Importancia de la ciencia en la vida cotidiana: microscopía IR

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Mercedes García de Polavieja Serradell >

Una de las grandes problemáticas que le aparecen a la ciencia a la hora de desarrollarse y poder avanzar cada vez un poquito más es, sin duda, la incapacidad de comunicación de los avances realizados. Para la gran mayoría, lo que acontece dentro de un laboratorio es algo imposible de imaginar, lejos de su alcance.

Es verdad que una sociedad como la que vivimos, tan especializada, es imposible esperar que todos los habitantes puedan abarcar los conocimientos que subyacen a los trabajos realizados por los investigadores. Sin embargo, con vistas a hacer entender a la población la importancia de continuar investigando conviene resaltar la necesidad de realizar dichos trabajos, es decir, como el avance de la ciencia mejora y simplifica nuestras vidas.

En base a esto, se presenta aquí un trabajo sobre microscopía IR, técnica de caracterización donde las haya, en el cual se pretende resumir brevemente, y de manera accesible a todos los públicos, la propia técnica en sí y aplicaciones actuales de la misma relacionadas con nuestro día y día y nuestra seguridad.

No debe perderse de vista, sin embargo, que la base conceptual, desarrollo y uso de la técnica conllevan una complejidad elevada. La formación de un buen microscopista es un proceso largo y costoso. La complejidad de la información obtenida y de la gran cantidad de la misma que se procesa requieren del desarrollo de un criterio químico elevado, si bien es cierto que la introducción de software informáticos cada vez más complejos simplifican el trabajo de los mismos.

El motivo por el cual la microscopía IR es una técnica perfecta para explicar al mundo como avanza la ciencia reside en la cantidad de aplicaciones directamente relacionadas con la vida cotidiana de las personas. Temas, por tanto, donde se puede entender como la ciencia nos beneficia. En particular, el trabajo se centrará en la resolución de pruebas forenses (fibras, cabello, huellas dactilares…) y en la detección de problemas sanitarios (tanto en el ámbito de la comida como en aplicaciones médicas).

INTRODUCCIÓN

Al hablar de microscopía IR lo primero que debe quedar claro es que se va a llevar a cabo una técnica que es, a su vez, la unión de dos técnicas anteriormente desarrolladas. Estas técnicas son la microscopía óptica y la espectroscopia IR.

Por norma general, todo el mundo ha visto alguna vez en su vida un microscopio y comprende, o tiene la idea, del funcionamiento del mismo (un sistema de lentes que por refracción nos permiten ver un objeto, demasiado pequeño para ser percibido, aumentado). Sin embargo, no es tan común que la gente conozca la espectroscopia IR. Es por esto que, a continuación, se hará una pequeña introducción a la misma, tratando de explicar que es, como funciona y para que sirve dicha técnica.


ESPECTROSCOPIA IR

Dejando de lado conceptos tan tediosos como energía, partiremos del concepto de que la energía electromagnética (que se atribuye a la presencia de un campo electromagnético) puede subdividirse en distintos grupos según el tipo de interacción que tiene con la materia. Uno de es estos subgrupos es el conocido como infrarrojo, que abarca la región comprendida entre 0’7-1000 µm y, cuya interacción con la materia provoca la vibración de las moléculas.

Este hecho es de suma importancia dado que para llevar a cabo dicha vibración en los enlaces de las moléculas estas absorben una cantidad de energía con la que se irradia que es proporcional a la fortaleza de dicho enlace. Esta es la información útil que se va a poder utilizar para caracterizar, de forma univoca, la sustancia sujeto de estudio.

Es decir, registrando la diferencia entre la energía que se aplica sobre la muestra y la que queda tras atravesar la misma, se puede conocer el tipo de enlaces que están vibrando, dado que cada enlace presenta unas frecuencias de vibración características, y, por ende, la sustancia de la que se trata.

En la figura 1 se aprecia la forma de un espectro IR, donde en el eje de coordenadas (y) se representa la cantidad de energía IR que se ha absorbido y en abscisas (x) a que frecuencia se realiza dicha absorción.

imageFigura 1. Aspecto general de un espectro IR.

Existen numerosas tablas donde se recogen los valores de vibración característicos para los distintos grupos funcionales de moléculas orgánicas. Así mismo, se están recopilando los espectros de un sin fin de moléculas en diversas bases de datos, que permiten la resolución de un espectro por simple comparación de los picos de mayor intensidad encontrados en el mismo.

Dicho así y observando la figura 1 parece que la resolución de un espectro IR para la obtención de una estructura es tarea fácil. No obstante, debe tenerse en cuenta que el espectro encontrado para cada molécula, o la complejidad del mismo, varia con su tamaño y el numero de grupos funcionales que presenta, dado que los enlaces formados dependerán también del entorno. Así, los espectros encontrados para moléculas grandes suelen ser tediosos, con numerosas bandas solapadas o cuya forma se ve modificada por las distintas interacciones que sufre la misma con la radiación.

Hasta aquí, lo que conviene resaltar es que la energía al interactuar con la materia nos proporciona la información necesaria para caracterizar dicha materia. En el caso que nos ocupa, al tratarse de radiación IR, esta información es de tipo estructural, mediante la medida de las vibraciones de los enlaces de la molécula.

Por último, cabe mencionar que, como es lógico, la cantidad de energía absorbida para una determinada vibración depende del numero de moléculas que hay en la muestra (a más moléculas absorbiendo, mayor será la intensidad de energía absorbida), por lo que esta técnica permite también realizar experimentos de tipo cuantitativo.

Esta técnica de espectroscopia IR se conoce como absorción, dado que las moléculas absorben la energía necesaria para llevar a cabo la vibración de sus enlaces y es esta absorción de energía la que nos proporciona información. Existen, sin embargo, técnicas de IR basadas en otros principios físicos. A continuación, se expone brevemente en que se basan estas otras técnicas:

1. Técnicas de reflexión

Se basan en la reflexión del haz IR producido por la muestra. Cuando el haz entra en contacto con la muestra pueden ocurrir tres tipos de reflexión: interna, especular y difusa, dándose, generalmente, las tres simultáneamente.

De esta manera, existen tres técnicas que miden cada uno de estos tipos, proporcionando unas información sobre la superficie externa y la otra sobre el interior de la muestra. En la figura 2 se muestran los esquemas de las distintas técnicas de reflexión utilizadas.

Reflexión especular: Se da en sólidos de superficie lisa, como la de un espejo. De esta forma, la radiación incidente y la reflectada poseen el mismo ángulo. La absorción de energía por la superficie a determinadas longitudes de onda hace que la intensidad del haz varíe, siendo el espectro muy parecido a los de absorción anteriormente descrito.

Reflexión difusa: Cuando la superficie del sólido en lugar de lisa es rugosa (polvo) la luz dispersada presenta distintos ángulos. Dado que en este caso la intensidad de la luz dispersada no es proporcional a la concentración deben hacerse uso de algoritmos que permitan obtener información sobre la misma. Normalmente se utiliza la ecuación empírica de Kubelka-Munk.

Reflexión totalmente atenuada: En este caso se recopila información del interior de la muestra. Utiliza la reflexión que experimenta la luz al pasar de un medio con alto índice de refracción a otro de menor índice (la muestra). Puede conseguirse la reflexión total aumentando el ángulo de incidencia.

Al estar ambos sólidos en intimo contacto y pasar la luz IR del primero al segundo se genera en la interfaz una onda evanescente que penetra en la muestra. Midiendo la absorción que se produce en el interior de la misma, se puede conocer la composición del interior de la muestra.

imageFigura 2. Esquema de las distintas técnicas de reflectancia en el IR. De izquierda a derecha: Reflexión especular (superficial, igual ángulo de incidencia y reflexión), reflexión difusa (superficial, dispersión en todas las direcciones) y reflexión totalmente atenuada (interior, absorción de la onda evanescente creada en la interfase sólido alto índice de refracción-muestra).

2. Técnicas fotoacústicas

Miden la variación de temperatura que se produce al absorber las moléculas la radiación IR para realizar la vibración de sus enlaces.


MICROESPECTROSCOPIA IR

Acoplando un microscopio óptico al espectroscopio lo que se consigue es, principalmente, la posibilidad de realizar medidas sobre muestras pequeñas. Si, además, tenemos en cuenta que los ensayos espectroscópicos mencionados anteriormente son, por norma general, no destructivos, lo que se obtiene es una técnica para la caracterización de muestras con una precisión elevada, cuyo tratamiento previo es mínimo (lo que evita contaminaciones o variaciones en la misma) y que puede realizarse sobre cantidades de muestra en el intervalo de los picogramos, sin necesidad de destruirlas.

La instrumentación utilizada es la mostrada en la figura 3. Pudiendo adaptarse, normalmente, el espectroscopio a las distintas técnicas del IR descritas anteriormente.

imageFigura 3. Microscopio óptico acoplado a espectroscopio FT-IR. Tal y como se aprecia en la figura, normalmente pueden ser utilizados tanto para medidas de transmisión (absorción) como de reflectancia, pudiendo obtenerse espectros de IR muy precisos para muestras de tamaño muy reducido.

La aplicación de esta técnica puede llevarse a cabo de distintas maneras:

Single point: Se realiza un análisis puntual. Es decir, se obtiene un único espectro IR del que se obtiene la información composicional.

Mapping: Se realiza un barrido de single points sobre la muestra. Por tanto, se obtienen numerosos espectros de toda la superficie de la misma. Posteriormente, se realiza la reconstrucción de todos los puntos para crear una imagen más grande. Actualmente existen sistemas para dotados de una fila de detectores, de manera que se reduce el tiempo requerido para este tipo de análisis.

Imaging: El desarrollo de detectores de matriz de plano focal permite obtener imágenes donde toda la superficie es analizada simultáneamente. En cada posición de la imagen hay un espectro, pero además en cada punto del espectro hay una imagen, de tal manera que la imagen en cada punto está definida por la composición de la muestra.

Esto conlleva, no sólo una reducción considerable en el tiempo necesario para realizar el análisis, sino la mejora en la resolución del espectro, aumentando también la sensibilidad.

A modo de resumen, el acoplamiento de estas técnicas permite obtener imágenes de tipo composicional sobre muestras cuyo tamaño puede ser muy pequeño sin necesidad de destruirlas.


APLICACIONES

Las características que presenta la microscopia de IR hacen de esta técnica la idónea para ser aplicada en un sinfín de ámbitos de toda clase. Podría pensarse que su uso principal es para la caracterización de sustancias sintetizadas por un laboratorio. Nada más lejos de la realidad. Utilizada en el campo de la astrología, historiografía, medicina, laboratorios forenses… su desarrollo a permitido grandes mejoras dentro de los mismos.

Como ya se refirió al principio del trabajo, las aplicaciones seleccionas están estrechamente relacionadas con nuestra vida cotidiana. En ese sentido, se refieren a pruebas forenses, siendo estas generalmente muy pequeñas (cabello, residuos de pólvora, drogas…) y medicas, cuya detección inequívoca es básica para la erradicación de contaminantes o para el posterior tratamiento del paciente.

CIENCIA FORENSE

El hecho de tener cantidades de muestra pequeñas supone dos problemas: el primero es la necesidad de recurrir a técnicas que posean alta sensibilidad (hay que

tener en cuenta que la absorción sufrida por la muestra es proporcional a la concentración de sustancias absorbentes en la misma y, por tanto, a menor cantidad de muestra menor señal de absorción) y que el uso de técnicas que requieren la destrucción de dicha muestra imposibilita la realización de otro tipo de medidas (ya sean para obtener más información o para la corrección de posibles errores en el laboratorio de análisis).

Es por esto que el desarrollo de la microscopia IR ha supuesto un gran avance para los laboratorios forenses. A continuación se exponen algunos ejemplos concretos de análisis realizados por estos laboratorios:

1. Pelo

No es posible identificar a un solo sospechoso mediante el uso de esta técnica, sin embargo permite conocer los posibles tratamientos que ha sufrido dicho cabello, ya sean tintes o productos. Las figuras 4 y 5 muestran las diferencias encontradas para un pelo tratado químicamente (blanqueado y permanente rizado) e impregnado con spray o acondicionador, respectivamente. Este segundo tipo de análisis podría ser utilizado para la identificación de los productos que utiliza un sospechoso.

imageFigura 4. Comparación de los espectros IR encontrados para pelo normal (sin tratamiento químico) y pelo tratado químicamente (blanqueado y con permanente). El aumento en la absorbancia de las bandas marcadas se debe a la oxidación de la cisteína presente en la queratina, que se produce al llevar a cabo el proceso de blanqueo.

Así mismo, los científicos tratan de buscar diferencias entre cabellos de distintos grupos étnicos, de tal manera que pueda reducirse el número de sospechosos.

imageFigura 5. Comparación de los espectros obtenidos para cabellos sin tinte y con spray. Realizando la sustracción del espectro del pelo puro del encontrado para el tratado puede encontrarse la información para identificar el tipo de spray utilizado. Este tipo de análisis debe realizarse mediante la técnica de reflexión totalmente atenuada, dado que el pelo es un gran absorbente de radiación IR y la realización de medidas de transmisión en su superficie es muy complicada.

2. Huellas dactilares

Es por todos bien sabido que las huellas dactilares son únicas para cada persona, lo que permite, teóricamente, la identificación inequívoca de un determinado sospechoso. No obstante, dos cosas deben tenerse muy en cuenta. En primer lugar, debe tenerse un patrón con el que comparar la huella encontrada para poder identificar al sospechoso. En segundo lugar, las parejas de gemelos comparten huella dactilar, luego no puede diferenciarse entre ellos.

Juega aquí también un papel importante la microscopía IR. Dado que la huella presenta componentes químicos puede ser analizada con el fin de encontrar residuos que permitan obtener más información sobre el sospechoso.

La figura 6 muestra las imágenes obtenidas para una huella dactilar que contenía residuos de madera, separados en la imagen c. Lo mismo podría ser utilizado para restos de pólvora, por ejemplo, pudiendo confirmarse el uso de armas de fuego.

imageFigura 6. De izquierda a derecha: imagen química, video imagen e imagen química destacando los residuos de madera encontrados en la huella dactilar.

3. Billetes

Tanto la tinta como el papel utilizado puede ser analizado por esta técnica sin necesidad de destruir las pruebas. Antiguamente, los billetes falsificados eran susceptibles de ser detectados a simple vista, sin embargo, el desarrollo de métodos de impresión cada vez más sofisticados hace necesario el uso de técnicas de caracterización muy sensibles.

imageFigura 7. Imagen química (arriba a la izquierda) obtenida del ojo de un billete de 20$ (arriba a la derecha). Una vez obtenida la imagen, puede obtenerse información química de la tinta, sin apenas interferencia del papel, mediante el uso de reflexión totalmente atenuada.

Como se ve en la figura 7 mediante la comparación de las imágenes del ojo de un billete americano, las imágenes obtenidas por microscopia IR son de elevada resolución. Además, puede obtenerse información sobre la tinta utilizada mediante la obtención del espectro IR haciendo uso de la técnica de reflexión totalmente atenuada.

CIENCIAS MEDICAS

Se incluyen aquí las pruebas realizadas directamente sobre pacientes para la detección de una posible patología, así como pruebas realizadas en alimentos, o productos que se encuentran en contacto diario con las personas, para el descarte de bacterias u otros contaminantes. A modo de ejemplo se incluyen, seguidamente, dos aplicaciones muy concretas:

1. Identificación de Listeria en alimentos

Existen seis tipos de bacterias listeria, tres de las cuales pueden generar infecciones a los humanos. En particular, la Listeria monocitogenes puede generar serías enfermedades en embarazadas y personas mayores o inmunosuprimidas.

La detección rápida de esta bacteria, que reside en alimentos tales como la leche, carne o pescados, es muy importante para la pronta retirada de los mismos.

Además de una forma rápida, la microscopia IR requiere pocas células para ser detectadas y distingue entre células vivas y muertas.

No obstante, su uso no esta aún automatizado. Es una técnica que se esta desarrollando y cuyos primeros resultados demuestran la valía de esta técnica para dicha caracterización, tal y como se observa en la tabla 1.

image

Tabla 1. Resultados obtenidos durante la identificación de las distintas especies de Listeria basados en espectros FT-IR obtenidos por un microscopia FT-IR. La identificación se realiza de la siguiente manera: se obtienen los espectros FT-IR de todas las especies, se realiza una primera etapa de discriminación mediante análisis canónico escalonado, obteniéndose los cuatro grupos mostrados en la tabla. Posteriormente, para llevar a cabo la separación de las especies del grupo 1, se aplica un análisis parcial discriminante por mínimos cuadrados.

2. Detección de cáncer

La técnica de microscopia IR permite distinguir perfectamente entre estructuras de tejidos sanos y aquellos que presentan patología. No requiere, además, del uso de colorantes, marcados… por lo que la muestra no se ve comprometida a posibles cambios durante su tratamiento.

El procedimiento llevado a cabo es la generación de bases de datos de espectros IR de tejidos dañados para distintos canceres: colorrectal, de próstata… y distintos grados de gravedad. De esta manera, por simple comparación de la imagen obtenida para un paciente concreto con los guardados en dichas bases de datos, puede detectarse la aparición de un tumor y el estadio del mismo.

En la figura 8 se observan las imágenes obtenidas con el microscopio para distintos grados de la enfermedad y las imágenes FT-IR obtenidas para un paciente real.

imageFigura 8. Selección de tejidos patológicos observados al microscopio y graduados según su agresividad ascendente del uno (tumor poco agresivo y bien diferenciado) al cinco (tumor escasamente diferenciado), arriba. Abajo, imagen FT-IR obtenida para muestras de 7mmx7mm, donde se aprecian los tejidos enfermos.


CONCLUSIONES

El desarrollo de la ciencia supone tiempo, dinero y mucho esfuerzo. No obstante, todo ello se ve recompensado rápidamente haciendo que la vida cotidiana sea cada vez sencilla. Es fácil entender que tener un microondas en la cocina reduce los tiempos y simplifica hechos tan cotidianos como calentar un vaso de leche.

En este trabajo, se ha querido mostrar como el uso de otras técnicas complejas benefician, de la misma manera, la vida de las personas. En concreto se a tratado la microscopia IR, por ser esta una técnica cuyas posibilidades de futuro sólo van en aumento, conforme se consiguen desarrollar nuevos detectores, fuentes de irradiación…

Las principales ventajas del uso de esta técnica, como ya ha quedado reflejado, son: alta resolución espacial obtenida, tiempo de análisis reducido, uso de pequeñas cantidades de muestra (sin o con muy poco pretratamiento) y ser un ensayo no destructivo.


BIBLIOGRAFÍA

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  • “Microscopía de imágenes FTIR en investigación Clínica.” Amparo Villar.AgilentTechnologies.

AGRADECIMIENTO

Al profesor Manuel Gil, que nos enseñó la importancia de explicarle al mundo lo que en la ciencia acontece.

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