Resúmenes del libro “Técnicas Fisicoquímicas en Medio Ambiente” – 12: “Técnicas cromatográficas”

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Bases de la cromatografía

La mayor dificultad con que el analista se encuentra cuando se ha de estudiar muestras ambientales suele ser su tremenda complejidad. Aunque existen tratamientos químicos que pueden aislar los analitos de interés, lo mejor es llevar a cabo un tratamiento fisicoquímico: la cromatografía. Hay muchas y variadas técnicas cromatográficas, pero el objetivo de todas es separar las sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente a un detector para que las determine y cuantifique. En general, estas técnicas se pueden clasificar en varias familias: cromatografía de gases, de líquidos, mediante fluidos supercríticos y en capa fina.

Todas se basan en el mismo fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla entren en contacto con dos fases (un líquido y un gas, un sólido y un líquido, etc.). Una de las fases es estática (no se mueve) y tenderá a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, móvil, tenderá a arrastrarlas. Cada sustancia química tiene distinta tendencia a ser retenida y a ser arrastrada. Dicho más correctamente, cada sustancia tiene distinto coeficiente de distribución entre las dos fases. El coeficiente de distribución es una medida de la tendencia relativa a quedar en una fase u otra.

Se opera de modo que en una primera etapa se deja que las sustancias que forman la mezcla entren en contacto con la fase estática. Cada sustancia de la mezcla tendrá una mayor o menor afinidad por esta fase. Después se hace pasar la otra fase, que arrastrará en mayor grado las sustancias menos afines por la primera. Típicamente, el proceso se lleva a cabo en una columna. Dentro de ella está fijada la fase estática y a través de ella se hace pasar la fase móvil, que se llama eluyente.

La muestra se introduce por la cabeza de la columna. Después se hace pasar el eluyente. Por el otro extremo empezarán a salir los distintos componentes de la mezcla, que podrán ser detectados con el detector correspondiente (de conductividad, ultravioleta, de masas…; en realidad, cualquier técnica de las estudiadas hasta aquí puede servir de base de detección, y también técnicas específicas ideadas especialmente para cromatografía). Existen dos tipos de detectores: universales y selectivos; los primeros detectan casi cualquier sustancia (aunque en distinto grado).

Un registro gráfico en el que aparecen una serie de picos (uno por cada especie separada) frente al tiempo de duración del experimento constituye un cromatograma. Las sustancias que dan lugar a cada pico pueden reconocerse por dos métodos. Uno es el análisis directo por alguna técnicas muy rápidas (IR, masas…); se realiza un espectro de la sustancia que eluye en cada momento y así se determina su naturaleza. Otro es usar patrones que se hacen pasar por la columna para medir el tiempo que tardan en ser eluidos. De este modo, comparando tiempos en los patrones y en la muestra se pueden identificar los componentes de la muestra, ya que el tiempo que tardan en eluir es una característica específica de cada sustancia. La cuantificación se lleva a cabo midiendo las áreas de los picos y comparándolas con las de patrones. Lo mejor es emplear el método del patrón interno para soslayar los inconvenientes de baja repetibilidad propios de las técnicas cromatográficas.

Ahora bien, este tiempo depende de muchas condiciones: el flujo (velocidad) de la fase móvil, su composición (la naturaleza del diluyente, que puede ser puro o una mezcla de varios), la temperatura (puede mantenerse constante o programarse para que varíe controladamente a lo largo del experimento), el tamaño de las partículas de la fase fija, la cantidad de muestra, etc. Cada experimento requiere unas condiciones diferentes. Si se observa que los picos solapan, deben cambiarse las condiciones hasta conseguir una buena eficacia separadora.


Cromatografía de gases

En cromatografía de gases la fase móvil es un gas llamado portador. La otra suele ser un líquido adsorbido sobre un sólido (cromatografía de gases gas-líquido) o, bastante menos comúnmente, un sólido (cromatografía de gases gas-sólido). Las columnas son finas y muy largas (por eso se arrollan). En esta técnica el control de la temperatura es fundamental, por lo cual la columna debe estar bien termostatizada (dentro de una estufa) durante todo el proceso. Existen dos tipos de columnas: rellenas (de fase estática) y abiertas (la fase estática está adherida a las paredes). Estas últimas son capilares. Su eficacia es mejor.

Como detectores se suele emplear el de conductividad térmica (que es universal y mide lo que baja la conductividad térmica del gas portador al mezclarse con cada especie separada); el de ionización en llama (la especie separada se quema, lo que en ciertos casos genera cargas eléctricas y una pequeña corriente proporcional a la concentración); o el de captura electrónica (basado en técnicas radiactivas). También se usan detectores generales como el de masas, IR, emisión atómica o algunos muy específicos como el de quimioluminiscencia de azufre.

La técnica ofrece unos excelentes resultados cuando se acopla con un espectrómetro de masas porque cada sustancia que va eluyendo puede ser fácilmente identificada. También se obtiene mucha información cuando se acopla al cromatógrafo un espectrómetro IR o uno de RMN.

La cromatografía de gases se aplica sobre todo a muestras orgánicas volátiles o volatilizables por derivatización. Pueden estar en estado sólido, líquido o, por supuesto, gas, pero muestras líquidas y sólidas deben vaporizarse previamente. La modalidad de gas-sólido permite detectar y cuantificar gases atmosféricos, por ejemplo.


Cromatografía de líquidos

En cromatografía de líquidos la fase móvil es líquida. Las columnas son mucho más cortas que en gases. El control de la temperatura no es tan crítico, pero sí ha de serlo el de la presión. Se ejercen presiones muy altas para hacer pasar la fase móvil (un líquido) a través de la estática (un sólido). Se aplica a especies no volátiles o térmicamente inestables.

El instrumento consta, además de la columna y detector, de una bomba de alta presión, un sistema desgasificador –los gases ensanchan las bandas– y una columna de sacrificio (precolumna) para eliminar materia en suspensión en los disolventes, polvo, etc., y un programador de disolventes para mezclarlos según se precise y de este modo mejorar el cromatograma.

El detector que más se emplea en cromatografía de líquidos es el de absorción UV. También pueden usarse un detector de IR, de masas, de RMN, de fluorescencia, de índice de refracción (este es muy universal) y en ciertos casos de conductividad iónica.

Según la propiedad fisicoquímica que se aprovecha para separar las especies de una mezcla se distinguen cuatro tipos básicos de cromatografía de líquidos: de reparto, de adsorción, de intercambio iónico y de exclusión por tamaño.

En la de reparto, la fase estática es un líquido unido a un sólido. Si este líquido es más polar que el de la fase móvil, la modalidad se llama de fase normal; si es no polar y la fase móvil es polar, se llama de fases invertidas. Esta se aplica más. En la de adsorción la fase fija es sólida; por ello la técnica se denomina también cromatografía líquido-sólido. La de intercambio iónico se emplea sobre todo para separar especies iónicas. La fase es una resina de intercambio iónico o material análogo. En la de exclusión por tamaño la fase fija es un material poroso; su función es retener en sus microtubos las especies de bajo peso molecular y dejar pasar moléculas más grandes. De este modo, las mayores eluyen antes.


Cromatografía mediante fluidos supercríticos

En este técnica se emplea como fase móvil una sustancia en condiciones de temperatura y presión tales que sea supercrítica (es decir, tenga propiedades intermedias entre un gas y un líquido), como el CO2 a más de 31 ºC y presión superior a 73 atm. Esta técnica reúne algunas ventajas de la cromatografía de gases y de la de líquidos. Es útil para compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no se detectan bien en cromatografía de líquidos. Lógicamente, en esta técnica es fundamental tanto el control de la presión como el de la temperatura. Una gran ventaja es que cuando el eluido se pone a presión y temperatura ambiente, el eluyente se evapora. Como detectores se suelen usar tanto los de cromatografía de gases como los de líquida.


Cromatografía en capa fina

En vez de en columna, se puede llevar a cabo la separación cromatográfica en un plano (un papel o una placa especial). La muestra se aplica sobre la fase móvil y sus componente son arrastrados hacia arriba, por capilaridad, por la fase móvil (líquida), o bien hacia abajo por gravedad o impulsados por una diferencia de potencial eléctrico. Se deja que los componentes de la mezcla se muevan a lo largo de la placa (unos más y otros menos, según su factor de retención o factor de retención relativo (frente a un patrón). Para medir este parámetro es necesario ver hasta dónde llega la mancha de cada analito. Para ello, la placa se ha de “revelar” mediante alguna sustancia química que forme algún productos coloreado o fluorescente con los analitos.

La identificación de los analitos de cada mancha también puede hacerse raspándola y analizándola por cualquier técnica. La cuantificación suele hacerse con ayuda de un densitómetro, un aparato que mide la densidad óptica o intensidad de cada mancha, que es proporcional a la concentración del analito que la genera.

Existen variedades de la técnica de capa fina como la de alta resolución, la bidimensional y la de fases invertidas.


Electrocromatografía capilar y electrofresis capilar

Otra técnica cromatográfica consiste en introducir la muestra en un capilar relleno y someterla a una alta diferencia de potencial. Eso crea un flujo electroosmótico que arrastra el disolvente desde el ánodo hacia cátodo. Cerca del cátodo se coloca un detector que va analizando los analitos que pasan por el capilar. La técnica, que se llama electrocromatografía capilar, Se puede aplicar a especies iónicas o no porque todas son arrastradas.

Una técnica relacionada, que no es cromatográfica porque no se basa en la diferencia de afinidad por dos fases, es la electroforesis capilar. El dispositivo es análogo al de técnica anterior, pero el capilar se rellena simplemente con un tampón, o bien se realiza en una placa. El fundamento de la técnica es que las especies avanzan impulsadas por el flujo electroosmótico pero también por atracción electrostática (los cationes se aceleran hacia el cátodo pero los aniones se retrasan por la atracción del ánodo). La técnica es útil para separar especies iónicas. Se pueden detectar por espectroscopía UV-visible, fluorescencia, técnicas radioquímicas o electroquímicas, espectrometría de masas o simple tensión.


En medio ambiente

La cromatografía se ha aplicado extensivamente en medio ambiente: gases de invernadero, compuestos orgánicos volátiles, hidrocarburos en suelos y agua, bifenilos policlorados, halofenoles, metales… Los cromatógrafos de gases acoplados con espectrómetros de masas se pueden “miniaturizar” y transportar al campo. También se han ideado práctico sensores cromatográficos.


MATERIAL DIDÁCTICO

Ejemplos de aplicación de las técnicas cromatográficas a problemas ambientales:

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