Para determinar la materia orgánica contenida en una balsa de retención de aguas residuales procedentes de una explotación porcina, se tomó una muestra de material a menos de un metro de distancia de la tubería de entrada en la balsa. Esta laguna anaeróbica (figura 1) tiene una capacidad de unos 7000 metros cúbicos y 3 m de profundidad máxima.
Se midió el pH y la conductividad de estas aguas en dos puntos: junto al canal de entrada de residuos (donde se tomó la única muestra) y en un punto diametralmente opuesto, constatándose valores iguales. De ese dato se dedujo que la composición era uniforme en toda la balsa. Se llenó una botella de vidrio ámbar de 1 litro. No se especifica en el informe, pero se supone, que se tomaron tanto sedimentos como líquidos y materia en suspensión. Tampoco se detalla si se homogeneizó previamente la zona de la toma de muestra.
A los 15 minutos de la toma, en la botella se observó a simple vista un sedimento y un sobrenadante más o menos turbio. (Según se comprobó posteriormente, el contenido tenía 32,4 gramos por litro de materia orgánica, una concentración sumamente alta.) La botella se sumergió en hielo y se transportó al laboratorio, situado a 8 horas de distancia, por la noche. Los análisis se hicieron nada más llegar la muestra al laboratorio. El objetivo del análisis era caracterizar exclusivamente la materia orgánica de estos residuos de forma fundamentalmente cualitativa.
Critique (positiva o negativamente) estos aspectos del muestreo. ¿Lo habría hecho usted así? ¿Habría tomado más muestras? ¿Habría seguido algún protocolo o plan de muestreo concreto? ¿Por qué se traslada la muestra de noche y en frío? ¿Por qué se analiza inmediatamente?
Sorprende que sólo se tome una muestra; va contra todas las normas de muestreo. Incluso si sólo se quiere muestrear un punto, por seguridad debieran haberse tomado dos botellas (precaución que habría permitido solucionar un problema que surge después: la pérdida de una fracción). Como sólo interesa un análisis cualitativo, tomar muestra cerca del canal del vertido puede ser suficiente, pero siempre es conveniente tomar más de una muestra aunque inmediatamente se junten todas en un mismo recipiente. Tampoco se especifica en el informe si se toma a cierta profundidad o al menos se garantiza que se hace una toma que represente a tods los estratos con el instrumento adecuando o agitando para poner los lodos en suspensión. El informe no comenta nada del procedimiento de toma de muestra, lo que resulta sorprendente. Cualquier comentario que el alumno haga en este apartado será valorado. Se pretende que el alumno piense profundamente en el problema del muestreo. Se conserva en frío para evitar descomposiciones, y por la misma razón de procede a analizar inmediatamente. Se hace el traslado de noche bien para no esperar (supóngase que se ha recogido la muestra por la tarde) o para evitar la luz.
Aprovechando propiedades como el diferente tamaño de partícula de los componentes sólidos y la distinta volatilidad, polaridad, carácter ácido, básico o neutro y formación de precipitados o floculados de las sustancias disueltas, la muestra fue sometida a una serie de tratamientos que la fraccionaron en 15 partes. Se siguió para ello un protocolo original de los autores del informe, consistente en una sucesión de centrifugaciones, tamizados, diálisis, extracciones, evaporaciones, liofilizaciones, ajustes de pH, separaciones en columnas cromatográficas, etc. Las figuras 1 y 2 ilustran el esquema de fraccionamiento empleado.
El instrumental empleado para el fraccionamiento fue:
- sendas columnas cromatográficas de resina de amberlita XAD-8 y XAD-4 (capaces de adsorber ciertas especies de una mezcla, según su polaridad, dejando pasar las otras) y de resina de intercambio de cationes.
- membranas de diálisis de base celulósica con un paso (cutoff) de 3500 daltons
- rotavapor
- liofilizador
- centrifugadora
Las 15 fracciones fueron clasificadas y estudiadas, básicamente, en tres grupos en función de la solubilidad inducida por los tratamientos:
- 6 fracciones de materia particulada (denominadas en el esquema “ác. húmicos”, “partíc. gruesas”, “partíc. medias”, “partíc. finas”, “part. floculadas I” y “part. floculadas II”)
- 3 de materia coloidal (“coloides I”, “coloides II”, “coloides III”)
- 6 de materia soluble (“ác. volátiles (sales Na+)”, “especies neutras hidrofóbicas”, “bases”, “ácidos hidrofóbicos”, “ácidos semipolares y especies neutras semipolares” y “ácidos hidrofílicos y especies neutras hidrofílicas”)
Comente los aspectos que desee del esquema de fraccionamiento. ¿Para qué se pasa por columna, dializa, liofiliza, centrifuga, acidifica, etc.?
Explicar sobre todo qué es una liofilización, una diálisis y el uso de estas columnas. El alumno puede emplear todo el material que quiera. Debería indicar que una liofilización es el secado de una materia congelada por sublimación del hielo; la diálisis es un procedimiento para separar coloides mediante membranas; la centrifugación separa precipitados de sobrenadantes; se acidifica bien para disolver precipitados o para obtener las especies moleculares ácidas a partir, por ejemplo, de la sal; el paso por columnas permite separar unas sustancias de otras…
¿Mediante qué procedimiento o con qué aparato se puede discernir inmediatamente si cada una de las fracciones del tercer grupo tienen carácter ácido, básico o neutro?
Midiendo el pH con un pH-metro.
Los únicos instrumentos analíticos (aparte del instrumental “menor” y común en todo laboratorio) de que se dispuso para la caracterización fueron:
- espectrofotómetro infrarrojo por transformada de Fourier con detector DTGS (los espectros se hicieron dispersando de 2 a 5 mg de materia orgánica sólida en bromuro potásico);
- espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear (200 MHz) provisto de sonda para realizar espectros de 13C de sólidos.
Para ayudar a las correspondientes asignaciones se usaron las tablas 1 y 2.
Tabla 1. Frecuencias características de vibración de algunos grupos moleculares de posible interés en este estudio
| Tipo de compuesto | Grupos y frecuencias de grupo características aproximadas (cm-1) |
| Carbohidratos | 3,400-3,300 (O-H), 1,100-1,000 (C-O) |
| Hidrocarburos alifáticos | 2,960, 2,870 (CH3), 2,940, 2,855 (CH2), 1,460 (CH2), 1,380 (CH3) |
| Hidrocarburos aromáticos | ~1,600 (Ar), ~1,480 (Ar), 650-900 (Ar-H) |
| Proteínas, péptidos | 1,660 (amida I, N-C=O), 1,540 (amida II, N=C-O). Ambas, muy características |
| Varios | Fosfato: aprox. 970 y 1100 |
| Lípidos | Depende de si son aromáticos o alifáticos; ácidos grasos (R-COOH), fosfolípidos, esteroides… |
| N-acetilaminoazúcares | 1,660 (amida I, N-C=O), 1,550 (amida II, N=C-O) 1,380 (CH3) |
| Lípidos | Algunas o todas estas bandas dependiendo del tipo de lípido: 1,760 (COOR), 1,720 (COOH), 2960 (CH3), 2,940 (CH2), 1,460 (CH2), 1,380(CH3) |
Tabla 2. Desplazamientos químicos RMN-13C de algunos grupos de posible interés en este estudio
| Grupo | Compuestos típicos en que aparece | d/ppm |
| C-H | Restos alifáticos | 0-55; en acetato: 22; en ac. hidrocinámico: 37, 42 |
| C-N | Aminas, amidas, proteínas | 40-55 |
| O-CH3 | Grupos metoxi en taninos y ligninas | 55-60 |
| C-O | Alcoholes alifáticos, éteres y ésteres | 60-90 |
| O-C-O | Carbonos anoméricos en carbohidratos | 90-110 |
| Ar | Aromáticos | 95-165, típicamente 120-140 |
| Ar-O | Aromatic esters, ethers, and phenols | 135-165 |
| Ar-SO3H | Ácidos sulfónicos aromáticos | 140-145 |
| -COO, O=C-N | Ácidos carboxílicos, ésteres y amidas | 160-190; en acetato: 190; en ác. hidrocinámico: 186 |
| O=C-C | Cetonas | 190-220 |
| Ácido N-acetilaldárico | 22, 60, 73, 76, 77, 173, 182, 183 |
¿Considera estas técnicas adecuadas para caracterizar la materia orgánica de la balsa? ¿Hubieran servido para determinar también los metales?
Estas son, efectivamente, técnicas muy adecuadas para identificar moléculas. Sin embargo, no se emplean para determinar metales. Para eso es mucho mejor la espectroscopía de masas o la emisión atómica.
En lo que sigue se comentan los resultados de los análisis y se muestran los espectros obtenidos, dividiendo el estudio en tres partes correspondientes a los tres grandes grupos mencionados.
A) Partículas
Las fracciones insolubles de tamaño de partícula mayor y medio (es decir, las denominadas “partíc. gruesas” y “partíc. medias” en el esquema de fraccionamiento de la fig. 1) revelaron a simple vista la presencia de fragmentos de pelo blanco de cerdo y restos no digeridos de vegetal verde y grano. Por lo tanto, es de esperar que el análisis de estas fracciones arroje como resultado, al menos, una mezcla de proteínas, lípidos y carbohidratos. Previsiblemente, las demás fracciones de partículas deberían tener una composición no demasiado distinta, aunque quizá en diferentes proporciones, o bien consistir en otros compuestos.
¿Básicamente, de qué tipo de molécula bioquímica cree que está formado el pelo? ¿Y los alimentos para cerdos?
El pelo es una proteína. Los alimentos para cerdos contienen carbohidratos, lípidos y proteínas. En particular, contienen lignina y polisacáridos.
A1
Se estudió inicialmente la naturaleza de lo que en el esquema de fraccionamiento de la fig. 1 (abajo) se ha denominado “residuo seco”. Se registró su espectro IR y se comparó con el espectro IR de un extracto de bacterias de bacillus subtilis que contenía esencialmente peptidoglucanos (fig. 3). (Nota: al final de este texto podrá encontrar un glosario con información adicional sobre especies químicas y procesos a los que se refiere este informe).
Según la información espectral, ¿en qué consiste químicamente lo que en el esquema de fraccionamiento se ha denominado “residuo seco”?¿Dónde se encuentra esta sustancia dentro de una laguna anaerobia? ¿Por qué aparece en el análisis?
Se trata, lógicamente, de peptidoglucanos, ya que los espectros son idénticos. Estos proceden de bacterias de la laguna de decantación. Han aparecido al romperse las paredes bacterianas debido a las extracciones y liofilizaciones (en particular, al congelar se rompen fácilmente las membranas porque el hielo tiene más volumen que el agua).
A2
La fracción que en el esquema se denomina “ác. húmicos” pudo caracterizarse categóricamente como constituida por tales ácidos gracias al espectro IR publicado de un ácido húmico típico. Por su parte la fracción llamada “part. floculadas II” en el esquema de fraccionamiento (fig. 1, parte inferior) se sospecha que es de naturaleza lipídica en sentido amplio, según estudios análogos anteriores y por ciertos indicios como su insolubilidad en agua (su hidrofobicidad) y el hecho de que se extrae con facilidad con diclorometano, algo que es propio de los lípidos. La fig. 4 contiene los espectros IR de estas dos fracciones y la fig. 6 (en su parte inferior), el espectro RMN-13C de las “part. floculadas II”. La fig. 5 es el espectro IR de un ácido húmico comercial (ojo: está en unidades de transmitancia).
Compruébese mediante las tablas de asignaciones IR (tabla 1) y RMN-13C (tabla 2) que la asignación que se ha hecho a “lípidos” de la fracción “part. floculadas II” es plausible. En todo caso, estos lípidos ¿son aromáticos o alifáticos? (es decir: ¿presentan o no núcleos bencénicos?). Hay muchos tipos de lípidos, entre otros los llamados ácidos grasos (R-COOH). ¿Los que se han encontrado en la balsa pueden ser ácidos grasos?
Son lípidos alifáticos básicamente (fuertes bandas en torno a 2900 y cerca de 1460). Si fueran aromáticos las señales en la zona 650-900, típica de los núcleos aromáticos, debería ser más intensa. Estos lípidos son del tipo ácidos grasos (R-COOH), como lo revela la presencia del grupo carboxílico -COOH. En el espectro RMN de “part. floculas II” domina un pico en torno a 36 ppm, correspondiente a los carbonos metilénicos, y también aparece el carbono carboxílico y prácticamente nada más, quedando claro que no hay carbonos aromáticos.
A3
Como ya se ha dicho, en las demás fracciones particuladas se espera encontrar lípidos, proteínas y carbohidratos mezclados, si bien según el tamaño de partícula las concentraciones relativas de estas tres familias de especies parece que van cambiando, según revelan los espectros RMN e IR de las fig. 6 y 7.
En RMN y en IR el área bajo la señal es proporcional a la concentración. Según, eso diga qué abunda más en las fracciones cuyos espectros se recogen en las figuras 6 y 7: proteínas, carbohidratos o lípidos (algunas bandas se marcan con asterisco para ayudarle a contestar). ¿Se le ocurre alguna explicación lógica para la abundancia relativa de proteínas, carbohidratos y lípidos en las distintas fracciones?
Como las áreas son proporcionales a la concentración en RMN (y en IR), el espectro superior de la figura 6 revela abundancia de proteínas (los tres asteriscos son bandas de proteínas); en el siguiente parecen destacar los carbohidratos, y en el siguiente los lípidos (comparar con el espectro inferior que es lípido casi puro). Los espectros IR corroboran esto.
Cuanto más gruesa es la partícula, más pelo se ve a simple vista (proteínas). Este pelo queda tamizado y no pasa a la siguiente fracción. A ella sí pasan los restos de alimento (carbohidratos y lípidos). Finalmente, estos quedan en el tamiz y sólo pasan a la tercera fracción (partículas finas) las moléculas de lípidos.
Los espectros de “part. floculadas II” y “part. floculadas I” son muy semejantes. Sin embargo, en el espectro de RMN (fig. 6), en la primera fracción no aparece el pico a aproximadamente 173 ppm que sí se aprecia claramente en los otros. Y en el espectro IR (fig. 7) de “part. floculadas I” aparecen las dos bandas señaladas con asterisco, las cuales no están en “part. floculadas II”. ¿Por qué?
La explicación es sencilla: “part. floculadas II” es lípido casi puro y “part. floculadas I” es lípido + peptidoglucano. Al retirar el peptidoglucano desaparecen las bandas correspondientes a los grupos peptídicos.
B) Coloides
Se hicieron estudios de solubilidad con la fracción “coloide I” y se comprobó que era soluble en disolución acuosa salina pero insoluble en agua desionizada. Esta circunstancia hizo pensar que se trataba básicamente de una globulina (un tipo de glucoproteína), un constituyente mayoritario del plasma celular.
Por su parte, por ciertos indicios se pensó en la posibilidad de que el “coloide II” era una N-acetilaminoazúcar.
En cuanto al “coloide III”, sus espectros revelan una naturaleza relacionada con las de los coloides I y II.
¿De dónde pueden proceder las globulinas halladas?
Igual que los peptidoglucanos, de las bacterias. Las extracciones y liofilizaciones múltiples rompen membranas bacterianas y liberan constituyentes del plasma celular como las globulinas. Esto hace suponer que buena parte de las que hay sean procedentes de biomasa microbial inicialmente viva.
Interprétense los espectros de los coloides I, II y III (figs. 8 y 9) para corroborar o no las suposiciones hechas, observando las diferencias entre ellos.
En RMN, el espectro del coloide III es prácticamente el del péptidoglucano. En RMN e IR, el coloide I da bandas típicas de proteínas, y el II también de carbohidratos.
¿Puede el coloide III ser el origen de los N-acetilaminoazúcares observados?
Es peptidoglucano, formado (ver el glosario) por la unión de un N-acetilaminoazúcar con el ácido murámico.
C) Especies solubles
Procedentes de los alimentos no digeridos se esperaría que aparecieran en las fracciones particuladas polisacáridos y lignina. Los primeros hemos comprobado que están, pero no la lignina, por lo que probablemente esté degradada. Uno de los productos finales de la degradación de la lignina es el ácido hidrocinámico (vea el Glosario). Por esta y otras evidencias se tiene la sospecha de que alguna de las fracciones de ácidos contiene ácido hidrocinámico.
Por otro lado, la fracción de “ác. volátiles (sales Na+)” olía a vinagre. Esto parece razonable porque el ácido responsable de dicho olor se produce en procesos de biodegradación vía tanto aerobia como anaerobia. Para que usted deduzca si están presentes o no los iones CH3-COO– en esta fracción, se acompaña un espectro IR de la sal sódica pura de esta especie (fig. 10).
Por otro lado, entre los ácidos también se espera la aparición del isovalérico, pues este es responsable de parte del mal olor en las explotaciones porcinas. Se sabe que el espectro RMN-13C de dicho ácido presenta varios picos anchos en la zona entre 40 y 50 ppm.
Los espectros IR y RMN-13C de algunas de estas fracciones de ácidos de distinta polaridad se muestran en las figuras 11 y 12. Los de RMN de las fracciones de ácidos semipolares y de especies hidrofóbicas neutras no se obtuvieron porque, según los autores del trabajo, la fracción se extravió (!!!). Sí se pudieron registrar los correspondientes IR (que aquí no mostramos), los cuales revelaron, en la fracción de “especies neutras hidrofóbicas” la presencia de hidrocarburos aromáticos orto-sustituidos y ácidos carboxílicos aromáticos.
El espectro de RMN de la fracción de “ácidos hidrofílicos y especies neutras hidrofílicas” muestra un pico muy agudo a 22 ppm que puede ser indicativo de la presencia de algún ácido N-acetilhidroxílico (derivados de la degradación de N-acetilaminoazúcares). Por estudios análogos previos se sospecha que se trata, concretamente, del ácido N-acetilaldárico.
Estúdiense los espectros de los ácidos. Con ayuda de las tablas de asignaciones dígase por qué son tales ácidos (qué banda los caracteriza fundamentalmente) y por qué, en el espectro IR, la banda que corresponde al grupo funcional característico de los ácidos orgánicos aparece a número de ondas tan anormalmente bajo en la fracción “ácidos volátiles (sales Na+)”
Porque está en forma de anión carboxilato (-COO–), no de grupo –COOH.
Sin consultar los espectros, pero sí las estructuras químicas (buscarlas en el glosario), si existe el ácido hidrocinámico, ¿en cuál de las fracciones se encontraría? ¿En cuál el acético? ¿Por qué es hidrofílico el ácido N-acetilaldárico?
Por lo comentado, el acético está en la fracción de sales sódicas de ácidos volátiles. El hidrocinámico debe encontrase en la fracción de ácidos hidrofóbicos (basta ver su estructura en el glosario). Basta ver la estructura del N-acetilaldárico en el glosario para ver por qué es hidrofílico (contiene muchos grupos –OH).
Suponga que le confirman que estos tres ácidos efectivamente existen y que son los únicos que aparecen en los espectros mostrados en las figuras 11 y 12. Investíguese mediante las tablas de asignaciones y teniendo en cuenta las estructuras de estos compuestos en qué espectros, tanto RMN como IR, podemos localizar el ácido acético, el isovalérico y el hidrocinámico
El acético (en forma de acetato) se observa en el espectro RMN de la fracción “ácidos volátiles (sales Na+)” por sus picos (ver la tabla RMN) a 22 y 190 ppm, y en el IR por la banda de carboxilato, a frecuencia más baja. El hidrocinámico es el de la región de “ácidos hidrofóbicos” porque es la única que muestra picos de núcleos aromáticos. En IR también se aprecian las bandas correspondientes a aromáticos. Finalmente, el N-acetilaldárico se localiza muy bien en los espectros de la fracción de “ácidos hidrofílicos” por sus intensas banda IR en la zona de los –OH (3300-3400 cm-1) y, en RMN, por sus típicas bandas (ver tabla de asignaciones) en torno a 75 ppm.
De la observación de los espectros IR, ¿qué banda(s) o grupo(s) químico(s) diferencia(n) claramente a los ácidos hidrofílicos y semipolares de los hidrofóbicos?
Bandas a 1000-1100 de grupos C-O (probablemente restos carbohidratados); grupos OH.
Posibles bandas de grupos aromáticos (aunque salen a solo 640).
Los semipolares tienen bandas de amida (1550 y 1650 cm-1).
¿Es aceptable no dar los resultados de una fracción por haberse perdido esta? ¿Es responsable la forma en que se hizo el muestreo de que no se puedan dar resultados completos en esta memoria?
Debería haberse tomado más muestras, al menos de reserva.
GLOSARIO
Ácido hidrocinámico: tiene la estructura que se ve al margen.
Pueden proceder de la degradación de la lignina (grupo de compuestos químicos usados en las paredes celulares de las plantas para crear madera; son polímeros amorfos a base de ácidos y alcoholes fenilpropílicos) previo paso por ácido ferúlico, como se aprecia en el siguiente esquema degradativo, que también conduce al ácido isovalérico:
Ácidos húmicos: son sustancias que se encuentran naturalmente en el humus del suelo, como parte de una familia llamada sustancias húmicas. Los ácidos húmicos son la fracción de esa familia que no es soluble en agua en condiciones ácidas (pH 2 o inferior), pero sí a mayores pH. (La fracción soluble bajo cualquier pH se suele denominar ácidos fúlvicos; por su parte, la humina es la fracción insoluble a cualquier pH.)
Los ácidos húmicos derivan de la degradación por microbios de biomoléculas (lípidos, proteínas, carbohidratos, lignina) cuando las células vivas mueren.
Ácido isovalérico: o ácido 3-metilbutanoico. Es en parte responsable del mal olor en las granjas de cerdos.
Ácido N-acetilaldárico: es un tipo de ácido N-acetilhidroxílico. Puede proceder de la degradación de peptidoglucanos bacteriales según el siguiente esquema:
Glucoproteínas: moléculas compuestas por una proteína unida a uno o varios azúcares, simples o compuestos. Los grupos sanguíneos dependen del tipo de glucoproteína que contiene la membrana de los eritrocitos; así, el tipo de sangre A tiene como oligosacárido una cadena de N-acetilgalactosamina (una N-acetilaminoazúcar). Las globulinas son un tipo de glucoproteína.
N-acetilaminoazúcar: por ejemplo, la N-acetilglucosamina (en la imagen) es un monosacárido derivado de la glucosa. La diferencia es que contiene un resto –NH-CO-CH3.
Lípidos: Extensa familia de sustancias bioquímicas que tienen una propiedad en común: son hidrofóbicas. Incluye ácidos grasos, grasas, aceites, ceras, fosfolípidos, esteroides y otros compuestos relacionados. Las grasas están compuestas de glicerol y ácidos grasos. Estos últimos, que también pueden considerarse lípidos,consisten en largas cadenas saturadas o no con un grupo –COOH terminal. Los fosfolípidos están formados por dos ácidos grasos, un glicerol y un fosfato. Los esteroides derivan del núcleo aromático ciclopentanoperhidrofenantreno. Algunos ácidos húmicos pueden obtenerse de la degradación de ciertos lípidos.
Peptidoglucanos: componentes mayoritarios de las paredes celulares de las bacterias. Es un heteropolímero formado por una secuencia alternante de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos mediante enlaces ß-1,4. El ácido N-acetilmurámico se une a oligopéptidos y así se forma la pared. Toda la capa es lo que habitualmente se llama peptidoglucano.
Fuente
Este ejercicio de interpretación de datos está basado en el trabajo Fractionation and Characterization of Organic Matter in Wastewater from a Swine Waste-Retention Basin, Scientific Investigations Report 2004-5217, United States Geological Survey (USGS), 2004, de Jerry A. Leenheer y Colleen E. Rostad. Se trata de un análisis químico realizado en 2004 sobre una muestra tomada de una balsa de retención de cierta instalación pecuaria.
Recurso
Los conceptos teóricos para resolver este ejercicio se pueden consultar en el libro Técnicas Fisicoquímicas en Medio Ambiente.
Este experimento pertenece al libro:
Mercedes Iriarte Cela y José M.ª Gavira Vallejo: Prácticas de Técnicas Instrumentales para Fisicoquímica y Medio Ambiente. Triplenlace.com, 2025 https://triplenlace.com/aula-libros/ptifqma/.
