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Leticia Gómez de Manuel »
Sin química no habría vida. No habría nada, no seriamos nada. Desde los inicios del mundo la química estaba ahí. Cuando los primeros elementos se enlazaron para formar la primera molécula, la primera organela, la primera célula… El bolígrafo con el que escribimos, el ordenador en que redacto este artículo…todo es Química. Y gracias a ella, encontré una pasión; la anatomía patológica y el trabajo en el laboratorio.
Desde el primer momento en que un cirujano extrae una pieza o fragmento del organismo necesitamos de un mecanismo de conservación para que procesos como la autolisis, la putrefacción, la alteración de las proteínas, etc. no se produzca. Aquí entra en juego la fijación.
La fijación es un procedimiento para conservar los tejidos en el estado más parecido posible a los procesos orgánicos, evitando la descomposición y transformación de las sustancias celulares. Existen muchos fijadores pero todos ellos tienen unas propiedades entre las que cabe destacar:
- Inhiben la acción de las enzimas intracelulares (evitan la autolisis).
- Son antisépticos, inhiben el crecimiento bacteriano (evitan la putrefacción).
- Coagulan el interior celular, haciendo insoluble la célula.
- Endurecen el tejido, para que su tallado sea más fácil.
- Aumentan la afinidad del tejido por colorantes.
La fijación inmoviliza las estructuras existentes mejorando los índices de refracción y ocasiona un endurecimiento de los tejidos para favorecer la microtomización y la conservación microscópica por lo que, un exceso del tejido en el líquido fijador también puede ser perjudicial para el propio tejido.
Para poder obtener cortes histológicos de 3-5 µm el tejido deberá acabar impregnado e incluido en una sustancia líquida que posteriormente adquiera una consistencia dura para su microtomización. Está sustancia puede ser de varios tipos, al igual que los líquidos fijadores pero la más usada en la parafina.
Las parafinas son unas mezclas complejas de hidrocarburos procedentes de la destilación del petróleo. Es sólida a temperatura ambiente y líquida a partir de los 56º C. Es insoluble en agua, por ello, para que los tejidos queden correctamente impregnados en ella primero deben sufrir una deshidratación gradual (50-70-96-100%) ya que, si no fuese así los tejidos se retraerían y podrían alterar la estructura del tejido.
Además de ser insoluble en agua, el alcohol inactiva la parafina por lo que necesitamos de un líquido intermedio en el cual la parafina sí sea soluble pero no la inactiva. Esto es el xileno. Existen también varios tipos de líquidos intermedios como por ejemplo el benceno que es el más volátil y se elimina rápidamente cuando se hace la impregnación. Pese a ser bastante tóxico, el xileno o xilol es el más utilizado debido a su bajo coste.
Al líquido intermedio se le conoce como líquido de aclaramiento, ya que, al ser soluble en alcohol aclara y limpia los tejidos de cualquier resto de alcohol antes de su impregnación en parafina. La impregnación es la última fase del tratamiento de los tejidos antes de su inclusión y posterior corte en el microtomo. Es una fase decisiva ya que si el tejido no penetra correctamente en los tejidos los cortes no serán de buena calidad. Los pasos de la impregnación se realizan en varias cubetas que deberán alcanzar los 60º C para que esta este completamente líquida. En una primera impregnación el xilol que queda en los tejidos es sustituido por la parafina pero esta queda con restos del xilol; por eso hace falta otro paso por una nueva parafina que no este contaminada del xilol. Una vez realizado todo el proceso de preparación del tejido (unas 12-14 horas) el tejido esta listo para ser incluido en parafina.
Se trata de realizar un bloque sólido de parafina con el tejido correctamente orientado para su corte. Esto se consigue en la estación de inclusión donde se dispensa parafina líquida a unos 57-60º C sobre moldes metálicos impregnados en glicerol para facilitar su posterior desmoldado.
La pieza debe orientarse correctamente, esto quiere decir, que si tenemos un fragmento de piel o una córnea deberá colocarse en el molde de canto para que al realizar el corte podamos ver todas las capas, desde la más superficial a la más interna.
Tras la obtención del bloque de parafina este se coloca en una placa fría con una temperatura entre 0 y -4º C. Es necesario que esté frío debido a que al realizar los cortes en el microtomo la fricción del bloque con la cuchilla derretiría la parafina. Una vez realizados los cortes se dejan en un baño con alcohol al 50% y se extienden en un baño de agua caliente a unos 37-45º C. Posteriormente los cortes se introducen en una estufa a unos 56-60º C para que el excedente de parafina se derrita y deje el tejido preparado para su tinción correspondiente.
Química de la tinción
Antes y después de cualquier tinción en el laboratorio de anatomía patológica hay que realizar unos pasos que son comunes a todas. Como recordaremos, en el procesamiento del tejido, este ha debido sufrir unos pasos de deshidratación y aclaramiento para preparar el tejido para ser embebido en la parafina, pues bien, para la coloración de los tejidos deberemos realizar estos pasos a la inversa.
Antes de cualquier tinción debemos sumergir los cortes en xilol para eliminar los restos de parafina que queden después de pasar por la estufa. Tras aclarar los cortes en el xilol, debemos hidratar el tejido por unos pasos graduales de alcohol (70-96-100%). Una vez hidratado el tejido lo sumergimos en agua y estará preparado para la coloración oportuna dependiendo de la patología o del propio tejido. Realizada la tinción, la intención es conservar por largo tiempo los cortes por lo que deberemos volver a deshidratar el tejido y aclarar el xilol, así los cortes deben montarse con un cubreobjetos y utilizar un medio que se mantenga permanentemente, que no sea miscible en agua; el más común es el Eukit Entellán. Es una resina semisintética mezclada con disolvente (similar al xilol) que es químicamente neutra (no afectará a nuestra coloración) y seca con rapidez, por lo que el tejido no se dañará.
La primera utilización conocida de un agente colorante para teñir un tejido animal data de 1714 por Van Leeuwenhoek. Empleó una solución de azafrán en vino para facilitar la observación de las fibras musculares estriadas de sus preparaciones histológicas.
Una coloración es el proceso por el que un cuerpo toma color por la acción de un colorante, que no es más que una sustancia que comunica color (son capaces de absorber la luz o radiación de la región visible del espectro). El color de un colorante corresponde a la radiación reflejada. Algunos colorantes tiñen de manera difusa, son malos colorantes, es preciso que exista contraste. Los buenos colorantes se fijan selectivamente sobre algunas estructuras celulares. Es decir, el fundamento de toda coloración se basa en la afinidad que poseen ciertos tejidos o componentes celulares por una sustancia colorante determinada. Muchos colorantes necesitan el efecto de otra sustancia para actuar, un mordiente. Estos pueden ser componentes del propio colorante o utilizarse de manera independiente.
Si conocemos la reacción química o propiedad física en que se basa una coloración, podemos deducir datos sobre las características de las estructuras a estudiar.
El soporte químico fundamental de la mayor parte de los colorantes tanto naturales como ratifícales son anillos aromáticos derivados del benceno.
El benceno es un hidrocarburo cíclico (C6H6) obtenido del alquitrán de hulla. Posee dobles enlaces deslocalizados entre los átomos de carbono. Existe una gran diversidad de derivados del benceno, y en consecuencia, de los colorantes de anilina (C6H5-NH2).
El benceno, como todos los hidrocarburos aromáticos, son sustancias incoloras aunque susceptibles de absorber radiación dentro del espectro de luz ultravioleta. Algunos derivados bencénicos pueden absorber radiación luminosa dentro del espectro visible y mostrar color.
La absorción de la luz se hace posible por la presencia en la molécula de grupos cromóforos, tales como –NO, -NO2, -NN-, que absorben luz por sí mismos. Al conjunto del grupo cromóforo y el anillo aromático se le conoce como cromógeno.
Para que un cromógeno se convierta en colorante deben existir sobre la molécula aromática otros grupos atómicos que le confieran la propiedad de disociarse electrolíticamente o de formar sales con los tejidos, Estos radicales se denominan grupos auxocromos o potenciadores del color y, por lo común, están dotados de carga eléctrica (poseen carácter ácido o básico) siendo los responsables de que el colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura a teñir.
Los auxocromos más frecuentes son los grupos: -OH, -COOH, -NR2, -NH2, -SH, etc.
En ocasiones, un colorante puede perder temporalmente su capacidad para absorber radiación lumínica dentro del espectro visible. Esto ocurre por un proceso de reducción del grupo cromóforo que lo transforma en un leucoderivado. El color suele reaparecer tras realizar una oxidación que restaura el grupo cromóforo, como ocurre con el reactivo de Schiff en la técnica llamada de PAS (siglas inglesas de ácido peryódico de Schiff).
Con esta técnica se determinan mucopolisacáridos neutros (son polialcoholes oxidados). Es una reacción poco específica pero enormemente selectiva mediante los correspondientes controles y puede colorear numerosos componentes bioquímicos. Fue descubierta simultáneamente pero de forma independiente por Hotchkiss, Mcmanus y Lillie en 1948.
El reactivo de Schiff es una leucofucsina derivada de la fucsina básica o pararrosanilina que reacciona con el ácido sulfuroso haciendo desaparecer un doble enlace de la molécula de fucsina básica:
Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos flanqueados por radicales –OH aparece de nuevo el doble enlace, el grupo cromóforo, y con él, la coloración roja fucsia característica.
Como el reactivo de Schiff solo reacciona con los aldehídos, antes necesitamos provocar la aparición de aldehídos libres sobre moléculas de polisacáridos. Esto se consigue mediante un paso previo por ácido peryódico que produce una oxidación de los alcoholes existentes en los polisacáridos en posición 1,2 glicol de los monosacáridos.
No sólo los polisacáridos neutros son compuestos PAS (+). Polisacáridos simples como el glucógeno y la celulosa; mucoproteínas como las mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio o bronquial, hormona TSH, megacariocitos; glicoproteínas del suero, membrana basal y fibras de reticulina; determinados pigmentos como el ceroide y ciertas lipofucsinas; y glucolípidos como gangliósidos y cerebrósidos también son compuestos PAS (+).
Clasificación de los colorantes
Los colorantes pueden clasificarse según el grupo auxocromo y la patencia tisular, así encontramos:
A. Colorantes básicos: el grupo auxocromo tiene carácter básico y se utiliza para teñir estructuras de carácter ácido, como los núcleos (hematoxilina o fucsina básica).
B. Colorantes ácidos: el grupo auxocromo es de carácter ácido y tiñe estructuras de carácter básico, como los citoplasmas (eosina, fucsina ácida).
C. Colorantes neutros: Se producen por la unión de carácter salino entre colorantes ácidos y básicos para formar un precipitado, comúnmente insoluble en agua y muy estable en disolución alcohólica. Su carga global neutra conserva la propiedad de colorear conjuntamente todo un tejido pero las estructuras adquieren tonalidades policromas (tinción de Giemsa).
D. Colorantes metacromáticos: algunos colorantes básicos derivados de la anilina tiñen estructuras tisulares con tonos de color totalmente distintos al que cabría esperar. Los colorantes metacromáticos son sustancias químicamente puras y no de carácter salino (azul de toluidina, azul de metileno).
La coloración de tejidos se basa en mecanismos físicos, químicos y físico-químicos. También existen clasificaciones de las diferentes técnicas de coloración dependiendo de las estructuras coloreadas.
1) Coloraciones topográficas: Muestran una visión de conjunto del tejido coloreado de forma que es posible separar todos sus componentes arquitecturales. Un ejemplo de este tipo son la hematoxilina-eosina (núcleos y citoplasmas) y las coloraciones tricrómicas (los núcleos se tiñen con hematoxilina; el colágeno con azul de anilina y citoplasma, queratina, fibras musculares, fibras intercelulares, depósitos fucsinófilos y fibrina con fucsina ácida)
2) Coloraciones citológicas: tiñen estructuras celulares. La más conocida es la técnica de Papanicolau, se trata de una técnica polícroma en la que debido a los diferentes colorantes utilizados podemos distinguir las células más viejas, el núcleo es el más pequeño debido a la perdida de actividad y las estructuras han perdido volumen. Además, cuanto más anaranjado quede teñido el citoplasma más vieja y terminal será la célula. En células escamosas el citoplasma será rosa, en celular intermedias azul claro o turquesa. Núcleos leucocitos y linfocitos, azul oscuro y hematíes rojos.
3) Coloraciones histoquímicas: Tiñen componentes químicos de las células, según el tipo de técnica empleada se obtienen distintos compuestos químicos y se clasifican en:
a. Histoenzimáticas: Se fundamentan en reacciones enzima-sustrato.
b. Inmunohistoquímicas: Reacciones antígeno-anticuerpo.
c. Hibridación in situ: Se fundamentan en la reacción de hebras complementarias de ácidos nucleicos.
Cabe destacar que la química que engloban las técnicas de hibridación in situ y las técnicas de inmunohistoquímica darían para un artículo individual cada una de ellas.
Con este artículo mi finalidad era acercar una parte del extenso trabajo de un técnico de anatomía patológica y como la química es la base de este y el gran conocimiento que se tiene sin tener unos estudios superiores. Lanzar un grito a todos los doctores de cualquier especialidad (medicina, química, biología, etc.), ya que muchas veces se olvida a los técnicos.
Los artículos de cualquier revista científica están llenos de primeros, segundos autores, colaboradores infinitos y al final, en pequeñito, en los agradecimientos, y no siempre, es donde suelen aparecer los nombres de los técnicos. Esos técnicos superiores, los cuales, muchas veces, conocen más detalladamente el desarrollo de cualquier investigación o tesis mejor que los doctores mismo.
Así mismo, me gustaría despedir el artículo con dos últimas fotografías. Los doctores buscan en el microscopio indicios de muchas cosas y, en ocasiones pasan por alto pequeños regalos que la ciencia misma nos regala como guiño para no perder la ilusión por nuestro trabajo. A mi, personalmente, encontrar estas células, al revisar mi trabajo bajo el microscopio, me animaba a seguir.
Bibliografía
- CARBONELL, V; COLOMER, R (2003). Apuntes sobre fundamentos de procesamiento y coloración.
- TORRES SECO, F (2001) Manual de técnicas en Histología y Anatomía Patológica. Editorial Ariel Practicum.
- GÓMEZ, L; ALFARO, L; PERIS-MARTINEZ, C (2010). Patología Corneal. X Congreso Virtual Hispano-Americano de Anatomía Patológica.
