Métodos analíticos de determinación de mercurio y trifluralina

Juan Rodríguez-Losada Allende »

Comentábamos en un artículo anterior la posibilidad de que ciertas especies de peces muy consumidos en España (en especial la panga y la perca) pudieran presentar alguna contaminación por mercurio y el pesticida trifluralina. En esta ocasión explicaremos cómo se pueden identificar analíticamente estos contaminantes en muestras de estos peces.

Métodos para la determinación de mercurio

Los metales pesados afectan a la cadena alimenticia por su bioacumulación. Ello es debido a su alta persistencia en el entorno al no tener, la mayoría de ellos, una función biológica definida.

El objetivo, por lo tanto, es proponer un método adecuado para llevar a cabo la correcta determinación de mercurio en los peces. Para ello, debemos llevar a cabo las diferentes etapas implicadas en el análisis para adecuar el estado de la muestra al método que vamos a proponer.

Estas etapas (muestreo, tratamiento de la muestra y evaluación) se describirán muy brevemente, mientras que en la descripción de la medida y del método a emplear nos centraremos más por ser éste el objeto del trabajo. Todos ellos se llevarán a cabo de la misma manera para la perca y para la panga, ya que sus características fisonómicas son muy parecidas y, por tanto, los contaminantes van a tener un comportamiento muy parecido, si no igual, en sus organismos.

1. Muestreo

Lo primero que debemos llevar a cabo es la selección de los organismos que vamos a analizar, tanto de perca como de panga. Para ello, tenemos que tomar una muestra representativa de la población total tanto en número como en características.

Podemos, por ejemplo, tomar diferentes individuos escogidos al azar de diferentes supermercados cerciorándonos de que su procedencia es la que queremos estudiar y que el pescado está fresco, de manera que no se haya producido una contaminación posterior (invasión microbiana,…).

2. Preparación de la muestra

Lo primero que tenemos que hacer es llevar a cabo el pretratamiento de la muestra, para lo cual hay que pensar que si la muestra está contaminada, aunque es posible que encontremos restos de contaminante por todo el organismo, habrá tejidos u órgano en los cuales se haya producido su mayor bioacumulación por cuestión de afinidades. Así, los metales pesados y por ende el mercurio tienen preferencia por los tejidos grasos (recordemos que la forma más habitual del mercurio en los organismos es la forma orgánica metilmercurio, lipofílico).

Por lo tanto, quizá sea interesante coger para el análisis el tejido graso del pescado o el hígado, previa disección del animal y secado en horno estufa a una temperatura tal que no produzca la descomposición de la muestra pero que a la vez permita su secado, por ejemplo a 40ºC, y variará en función del órgano. Se mantendrá el tiempo necesario para alcanzar el peso de masa seca.

A continuación comenzamos con el tratamiento de la muestra. Para ello se propone una digestión en vía húmeda de la muestra en un horno de microondas.

Las microondas son ondas electromagnéticas localizadas dentro del espectro electromagnético en un intervalo de frecuencia que va de 300-300.000MHz. Su radiación no tiene propiedades ionizantes, no produce cambios en la estructura molecular y origina el movimiento de las moléculas debido a la migración de iones y a la rotación de dipolos.

Se propone la adición de ácido nítrico, al cual no hace falta añadirle otro ácido (como el clorhídrico) porque estamos trabajando con una matriz orgánica cuya descomposición se controla mediante la temperatura, es decir, ajustando el potencial oxidante del ácido nítrico.

Sin embargo, al tener en su composición una elevada carga lipídica con una larga cadena hidrocarbonada, solo posee algunos carbonos parcialmente oxigenados por lo que su descomposición se hace más compleja, en comparación por ejemplo con matrices orgánicas compuestas únicamente a base de carbohidratos. Para conseguir una descomposición óptima tendremos que emplear temperaturas más elevadas.

Todo esto, introducido en el vaso de teflón puede introducirse en el equipo de microondas y comenzar con el proceso de digestión al que se le programará un aumento progresivo y gradual de la temperatura y de la presión en el interior de los vasos para favorecer la extracción [1], es decir, la eliminación de la materia orgánica de la muestra y liberación de los metales pesados.

Cuando ha terminado la digestión, se trasfiere el líquido que contiene el analito a matraces aforados y se enrasa con agua destilada, de manera que rebajemos un poco la concentración.

3. Medida

Una vez eliminada la materia orgánica por digestión vía húmeda se puede proceder a la determinación de la concentración de mercurio. Para ello se proponen dos técnicas:

a. Técnica de vapor en frío de absorción atómica

La absorción atómica, a la que nos referiremos como AA, es un método instrumental de la química analítica que nos permite determinar una gran variedad de elementos al estado fundamental como analitos.

La técnica de vapor frío solamente es aplicable a la determinación de mercurio ya que es el único elemento metálico que tiene una presión vapor apreciable a temperatura ambiente.

Lo primero que tenemos que hacer es colocar en un recipiente la disolución y añadimos cierta cantidad de cloruro de estaño(II) para reducir el mercurio a su estado elemental.

El vapor de mercurio generado es liberado de la disolución por el borboteo que produce la corriente de aire (gas inerte con un caudal aproximado de 1 l/min) en el seno de la muestra y es arrastrado por dicha corriente hasta la celda de medida y allí se determina el contenido en mercurio por espectrofotometría de absorción atómica sin llama a 253,7nm.

La cuantificación se efectúa frente a una curva de adiciones conocidas previamente elaborada a partir de una serie de patrones.

En este caso, para la determinación de la concentración del analito solo podremos recurrir a la ley de Lamber-Beer cuando estemos trabajando con disoluciones muy diluidas debido a las interferencias que se producen en los demás casos.

b. Emisión atómica con plasma acoplado inductivamente

Su objetivo es el estudio de la radiación procedente del descenso de los electrones desde los niveles electrónicos más energéticos al estado fundamental después de que éstos sean excitados (irradiados) con una fuente de emisión.

El proceso podríamos resumirlo de la siguiente forma:

El fundamento del método es análogo al de la técnica de AA; el plasma recalentado es inducido en un campo magnético y se forma una antorcha plasmática que es espectroscópica.

Se puede generar un plasma acoplado por inducción al dirigir la energía de un generador de frecuencia hacia un gas apropiado, comúnmente argón.

Este inductor genera rápidamente un campo magnético que produce la ionización del gas argón entrante, iniciada con una chispa de la llamada espiral de Tesla. Los iones resultantes y sus electrones asociados luego interactúan con el campo magnético fluctuante. Esto genera energía suficiente para ionizar átomos de argón por excitación de choque.

Los electrones generados en el campo magnético son acelerados hacia la antorcha. A altas velocidades, los cationes, aniones y electrones conocidos como corriente turbulenta (corriente de Eddy), colisionarán con los átomos de argón para producir mayor ionización, lo que produce un gran aumento de temperatura.

En cuestión de microsegundos, se crea un estado estable con alta densidad electrónica. Se produce plasma en la parte superior de la antorcha. La temperatura en el plasma suele estar alrededor de los 8000 K.

Esta antorcha de alta intensidad luminosa es la fuente espectroscópica que permite la técnica analítica. La misma contiene todos los átomos del analito y los iones que fueron excitados por el calor del plasma.

Por lo tanto, el principal motivo por el que se utiliza el plasma como fuente de excitación es porque ofrecen varias ventajas comparadas con los métodos de llama y electrotérmicos. Una de las ventajas constituye la de ser una técnica para elementos múltiples y tiene un amplio rango de trabajo. Las fuentes de plasma actuales brindan un método mucho más fácil para la manipulación de muestras gaseosas y líquidas y debido a las temperaturas alcanzadas apenas hay interferencias y se produce la atomización de cualquier muestra. El espectro para docenas de elementos puede ser registrado al mismo tiempo, algo muy importante cuando la muestra es pequeña.

De manera que el sistema de introducción de la muestra en el equipo es la misma que para el método anterior, lo único que varía es la fuente de excitación.

Método para la determinación de trifluralina

A continuación se va a proceder a la descripción de las diferentes etapas implicadas en el proceso analítico.

1. Muestreo

Como ya comentamos, la etapa de muestreo será análoga a la realizada en el caso anterior para la determinación de mercurio.

2. Preparación de la muestra

En cuanto al pretratamiento de la muestra, el procedimiento es el mismo que antes. Dado que la trifluralina tiende a acumularse en las partes grasas del cuerpo, para obtener mejores resultados es recomendable emplear para el estudio este tipo de tejidos o el hígado previamente secados y llevados hasta peso de masa seca.

Las diferencias con respecto al método empleado para la determinación de mercurio empiezan con el tratamiento de la muestra.

Igual que ocurría antes, tenemos que proceder a la extracción del pesticida de la matriz orgánica que lo contiene; ahora bien, la extracción de compuestos orgánicos difiera sustanciosamente de la extracción de compuestos inorgánicos sobre todo porque existe una mayor susceptibilidad del analito de ser alterado, por lo que tenemos que escoger un método de análisis que no altere su composición o, en el caso de que lo haga, sea de una forma perfectamente controlada, lo que no siempre es sencillo.

Para llevar a cabo la extracción se pensó en un primer momento realizar una extracción con ultrasonidos focalizados. Sin embargo, debido a la relativa facilidad que tiene la trifluralina para evaporarse, se tiene que recurrir a otro método para separarla del resto de la matriz orgánica.

Se propone, por lo tanto, una extracción en fase sólida (SPE). Se trata de una técnica de limpieza de la muestra que es al mismo tiempo sencilla, potente rápida y económica.

Para llevarla a cabo utilizaremos una columna SPE, que consiste en un lecho adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo desechable. La SPE permite la preconcentración de la muestra con un riesgo mínimo de pérdida o contaminación de la misma. El analito se queda retenido en una fase sólida mientras que el resto de los compuestos se eluyen.

Las etapas de la extracción en fase sólida son:

1. Activación: consiste en humidificar con un solvente orgánico la fase sólida.
2. Acondicionamiento: con el mismo solvente de la matriz, lo que favorecerá la interacción analito-fase estacionaria. Cualquier solvente orgánico residual lo eliminamos en esta etapa.
3. Retención: las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente de SPE.
4. Eliminación de interferencias: usando un solvente o una serie de solventes de fuerza creciente los contaminantes pueden eliminarse del adsorbente de SPE hasta que solo los analitos de interés queden atrapados.
5. Elución: se efectúa empleando un eluyente adecuado.

El procedimiento analítico es el que se describe a continuación [2]. Se toma una muestra de aproximadamente 2,5 gramos de tejido graso o hígado como ya mencionamos de pescado contaminado y le añadimos alrededor de 25ml de acetonitrilo. A continuación, procedemos a la homogeneización utilizando un politrón [3]. Una vez que hemos homogeneizado adecuadamente, centrifugamos para separar las fases a 1500 rpm sobre 5 minutos. Finalizada la centrifugación observamos la separación en dos fases, de manera que en el sobrenadante quedan los compuestos de interés y, entre ellos la trifluralina, y en el residuo los restos de materia orgánica. Decantamos el sobrenadante aunque no nos hará falta todo, tan solo 15ml son suficientes y los diluimos hasta 50ml con acetonitrilo en un matraz aforado de dicho volumen.

Hasta ahora hemos llevado a cabo la extracción de los compuestos de la matriz orgánica, pero ahora debemos depurar un poco más la muestra, para lo cual trabajaremos con una columna SPE de C₁₈ y florisil.

Se introduce la dilución a la columna a una velocidad adecuada, de aproximadamente 3 gotas por segundo y cuando no quede más y se haya eluido todo el extracto, se aclara con agua y, a continuación se eluye la columna doblemente con 5ml de agua. Cuando todo el agua se ha eluido se seca de entre 10 y 15 minutos haciendo vacío (aspirando). Posteriormente se adicionan 6ml de tolueno-petróleo éter al 3% y se deja en contacto 3 minutos a una velocidad de 3 gotas por segundo.

Por último, ya podemos recoger los productos de elución donde se encuentran los compuestos de nuestro interés, que tendremos que proceder a separar mediante alguna técnica analítica.

3. Medida

Una vez que hemos conseguido aislar los pesticidas del resto de la matriz orgánica, podemos llevar a cabo su determinación.

La técnica analítica que se propone es la fluorescencia fotoinducida (PIF) cuyo fundamento es el que sigue.

La fluorescencia molecular es un método de análisis potente dada la alta sensibilidad y selectividad que posee. Sin embargo, muchos compuestos presentan una nula o muy débil fluorescencia, lo que hace que su determinación fluorimétrica sea inviable o de muy baja sensibilidad.

A veces, la radiación UV produce la fotólisis del analito originándose cambios en su fluorescencia. Este fenómeno ha dado lugar a que se haya propuesto una modificación del método basado en la fluorescencia molecular, que mediante el uso de reacciones fotoquímicas aumente la sensibilidad, selectividad y reproducibilidad de la detección fluorimétrica. Este método se denomina “Fluorescencia inducida fotoquímicamente a temperatura ambiente” (Room Temperature Photoinduced Fluorescence), “RTPF” o simplemente “fluorescencia fotoinducida”, (Photo-Induced Fluorescence), que denominaremos con las siglas PIF.

Cuando el fotoproducto (sustancia resultante de las reacciones fotoquímicas en las que se ha visto involucrado el analito) es menos fluorescente que el analito la señal medida es la disminución de la fluorescencia. No obstante, en la mayoría de los compuestos [entre ellos la trifluoralina] la reacción fotoquímica conlleva un aumento del coeficiente de absorción y del rendimiento cuántico de la fluorescencia con relación a los del analito. Por tanto, el aumento de la señal de fluorescencia del fotoproducto origina un aumento de la sensibilidad de la detección fluorimétrica.

Llegados a este punto han de considerarse dos posibilidades:
1.- Que el analito sea fluorescente y el fotoproducto no, por tanto, tiene lugar una disminución de fluorescencia.
2.- Que el analito sea débilmente fluorescente o no fluorescente y el fotoproducto sea fuertemente fluorescente, en consecuencia, se observa un aumento en la fluorescencia.

Es importante conocer ante qué caso nos encontramos para luego poder estudiar de qué forma están relacionados la concentración inicial del analito con la señal de fluorescencia final. Pero ya hemos comentado que nosotros nos encontramos en el caso del punto 2).

Para que la reacción sea útil desde el punto de vista analítico debe reunir los siguientes requisitos:

• El analito debe absorber fuertemente en la región del UV para que se inicie la reacción fotoquímica.
• La radiación absorbida debe ser de una longitud de onda que no sea absorbida significativamente por el o los fotoproductos.
• Debería existir un aumento del coeficiente de absorción y un rendimiento cuántico de fluorescencia de los fotoproductos mayores que los del analito (por ejemplo mediante un aumento de la aromaticidad).
• Química y térmicamente los fotoproductos deberán ser estables al menos en el intervalo de tiempo necesario para la realización de las medidas.

En un equipo para la medida de la fluorescencia fotoinducida el componente diferenciador de un espectrofluorímetro típico (ver imagen que sigue) es el fotorreactor, donde se llevarán a cabo las diferentes reacciones de transformación del analito en fotoproductos más fluorescentes, siendo éste la parte fundamental del sistema.

El problema fundamental es que no se comercializan instrumentos para PIF por lo que los existentes son fruto del diseño y fabricación de los propios investigadores.

Este es el fundamento de la PIF, sin embargo, para la determinación de pesticidas es interesante utilizarlo acoplado a HPLC:

Para la trifluoralina la fase móvil más indicada es metanol:agua (fase móvil con cambios en la polaridad) y una fase estacionaria polar de naturaleza semejante a la del pesticida.

Una vez producida su separación en la columna de HPLC los compuestos, en función de su afinidad por las diferentes fases van siendo arrastrados hacia el fotorreactor donde la lámpara UV produce el inicio de las reacciones. En ellas se generarán una serie de subproductos de la trifluoralina que presentarán una mayor fluorescencia que la del analito de partida, que será registrada y medida en el fluorímetro que le sigue.

Dado que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de analito en la muestra (para concentraciones ≤ 0,05g/l) se cumple:

I = k · C

donde I es la intensidad, k es una constante de proporcionalidad y c es la concentración del analito.

Otra opción es utilizar como técnica analítica para la determinación de la trifluoralina, en lugar de HPLC acoplada a la fluorescencia fotoinducida como detector, cromatografía de gases equipada con detector de captura de electrones. Según esta cromatografía los diferentes compuestos se separarán en función de su volatilidad; la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica programada con una rampa de temperatura. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna hasta un detector, que en este caso es de captura de electrones. Es uno de los detectores (de respuesta selectiva) más ampliamente utilizados porque es sensible a compuestos orgánicos que contienen halógenos, como es el caso del herbicida que estudiamos; el eluyente de la muestra procedente de la columna pasa por un emisor de partículas β radiactivo, casi siempre níquel-63. Un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador y la producción de una ráfaga de electrones. Cuando no hay especies orgánicas se forma una corriente constante entre un par de electrodos a causa de este proceso de ionización. En cambio, la corriente disminuye de manera notable si hay moléculas orgánicas que contengan grupos electronegativos que tiendan a captar electrones. Una de sus principales ventajas es que esta técnica no altera la muestra como lo hace el detector de flama, que consume la muestra.

Los métodos que se han propuesto para el análisis de estos contaminantes son solo un ejemplo de los muchos que hay.

Lo importante es escoger el método que más se adecue a la consecución de los objetivos perseguidos en el estudio y que arroje resultados fiables con una elevada sensibilidad y selectividad.

En base a los resultados que obtengamos para la concentración de mercurio y trifluoralina en las muestras de pescado seleccionadas y analizadas, podremos saber si éstas cumplen o no con la normativa, tanto comunitaria como nacional.

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[1] Una alternativa al horno de microondas sería la digestión en un bloque calefactor. Este procedimiento, no obstante alargaría mucho el análisis y requiere mucha más presencia del analista.
[2] SUN, Feei, Determination of Organochlorine and Nitrogen-Containing Pesticide Residues in Fish with Different Fat Content, Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substance Research Institute, Council of Agriculture, 2000.
[3] Aparato cuya finalidad es llevar a cabo tareas de homogeneización y/o dispersión.