SERS: microscopía Raman mejorada

Mercedes García de Polavieja Serradell »

La espectroscopía Raman es una potente técnica de caracterización de sustancias, debido a la generación de espectros que actúan como huella dactilar de las mismas [1,2]. Entre las principales ventajas que presenta cabe destacar la posibilidad de realizar estos espectros sin apenas tratamiento previo de la muestra siendo, además, una técnica no destructiva.

De este modo, la técnica puede ser aplicada en diversas áreas, como la medicina, la ciencia forense, bioquímica, ciencia de los materiales… de forma sencilla y muy específica.

No obstante, pese a las grandes cualidades que presenta le espectroscopía Raman, la existencia de algunos inconvenientes, reducen el campo de aplicación de la misma o hacen que su uso resulte más tedioso. En particular, la baja sección eficaz que presenta está técnica y la competencia entre el efecto que la genera con fenómenos luminiscentes, de intensidad muy superior, hacen que la versatilidad de la misma se vea muy reducida [1-3].

El descubrimiento de la espectroscopía Raman intensificada por superficies (SERS), que proporciona una sección eficaz muy superior y “bloquea” o reduce considerablemente los fenómenos de fluorescencia, abre la puerta al uso de la espectroscopia Raman para un mayor variedad de sustancias y tipos de muestra que anteriormente no eran idóneos para su caracterización por medio de esta técnica[3,4], obteniéndose la estructura y composición de una muestra. Además, puede obtenerse información de reacciones, dado que pueden monitorizarse en tiempo real y extraer información sobre los intermedios de reacción [3], o la orientación con la que las moléculas a analizar se unen a la superficie [1,5]… siendo actualmente la técnica más sensible para el estudio de superficies [2].

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Dispersión Raman

La espectroscopia Raman estudia las transiciones vibracionales de una molécula en función de la polarizabilidad de las mismas.

Así, cuando una fuente lumínica interacciona con la nube electrónica de los enlaces de la molécula, excitándose uno de los electrones hasta un estado excitado virtual (es decir, no salta al siguiente nivel electrónico, sino a un estado intermedio virtual). La relajación de este electrón se realiza por medio de la emisión de un fotón [1].

La dispersión generada puede ser elástica, cuando la energía implicada es la misma al ser el nivel vibracional inicial y final el mismo, o inelástica, cuando al ser distintos los niveles de partida y llegada la energía de los fotones implicados es distinta. El primero se conoce como Rayleigh mientras que el segundo es la dispersión Raman que nos ocupa [1].

Esta dispersión Raman puede ser a su vez de dos tipos:

• Stokes: Las moléculas se encuentran inicialmente en el estado vibracional fundamental pero al ser excitada y, posteriormente, relajarse el nivel de llegada es un estado vibracional excitado. La energía del fotón dispersado es menor que la del incidente, produciéndose un desplazamiento de la longitud de onda hacia el rojo.
• Anti-Stokes: Inicialmente se encuentra en un nivel vibracional excitado pero el nivel de llegada es el estado fundamental, siendo la energía mayor y produciéndose el desplazamiento de la longitud de onza hacia el azul.

En la figura 1 se observan los fenómenos Raman (Stokes y Anti-Stokes), así como la dispersión Rayleigh. Este diagrama de Jablonski muestra, asimismo, la absorción infrarroja, técnica complementaria a la Raman, y el fenómeno de fluorescencia, que compite habitualmente con el Raman, dado que presenta una sección eficaz muy superior (~10-16 cm2/molécula frente a ~10-31-10-29 cm2/molécula para el Raman) [4].

La sección eficaz, comentada anteriormente como una de las mayores desventajas que presenta la espectrosccopía Raman, depende de la fracción de fotones que generan un determinado efecto. Así, el numero de fotones Raman dispersados es muy pequeño, uno de cada 1011 fotones incidentes, dado que la mayor parte de los mismos se dispersa elásticamente o genera fluorescencia. Del mismo modo, la emisión Raman Stokes es mucho mayor que la Anti-Stokes, dado que a temperatura ambiente las moléculas se encuentran, mayormente, en estado vibracional fundamental [1].

Las señales Raman obtenidas son, de esta manera, de intensidad baja, siendo esta intensidad proporcional al momento dipolar inducido por el campo externo, que depende a su vez de la deformación de la nube electrónica, es decir, la polarizabilidad. La baja intensidad de las señales obtenidas (muy inferiores a las de fluorescencia y dispersión Rayleigh) es la mayor desventaja de la espectroscopía Raman y fue la causante de que durante varios años esta técnica se encontrase muy restringida hasta que se desarrollaron detectores con mayor sensibilidad y fuentes de excitación con la intensidad adecuada [3].

El posterior descubrimiento de la técnica SERS ha abierto el uso de la espectroscopía Raman a un gran número de aplicaciones, siendo posible su uso en muestras muy diluidas e, incluso, a nivel traza [6].

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Espectroscopía Raman intensificada por superficies: SERS

En la década de los 70 Fleischmann, Hendra y Mcquillan, investigadores británicos, descubrieron que la señal Raman obtenida para una muestra de piridina adsorbida sobre un electrodo de plata rugoso era muy superior a la del espectro Raman convencional [1,2,4,5], tal y como se aprecia en la figura 2.

En un primer momento se atribuyó este efecto al aumento del área superficial por la textura rugoso, siendo esto lo que trataban de demostrar los investigadores anteriormente citados, de este modo se le puso el nombre “intensificada por la superficie”. Sin embargo, se trata de una intensificación por nanoestructura o asistida por plasmones [2,5].

MECANISMOS DE INTENSIFICACIÓN

Este fenómeno se ha atribuido a dos mecanismos distintos: mecanismo de intensificación electromagnético y de transferencia de carga o químico; siendo el primero excluyente, de forma que el segundo no ocurre sin este, y el segundo no imprescindible, dependiendo de la naturaleza de la molécula, las condiciones experimentales y si se da o no una interacción por enlaces entre la molécula y el substrato [1].

1. Mecanismo electromagnético (EM)

Para comprender este efecto hay que saber primero las propiedades ópticas de las nanoestructuras metálicas cuando se encuentran en contacto con un dieléctrico. Esta unión genera oscilaciones colectivas de los electrones que se encuentran libres en la interfase, conocidas como plasmones de superficie. Estos se excitan al ser irradiados con radiación electromagnética generando ondas electromagnéticas que se propagan por la interfase, a no ser que la superficie de la nanopartícula sea morfológicamente no homogénea, en cuyo caso estas ondas quedan confinadas en áreas pequeñas y localizadas, siendo plasmones de superficie localizados (LSP).

Cuando se hace incidir un fotón en condiciones de resonancia sobre estos LSP se excitan lo que se traduce en una polarización de la nanopartícula, por medio de la resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR), siendo está la base del mecanismo de intensificación EM [5].

La intensificación de la señal Raman es debida, entonces, a que sobre la molécula a caracterizar no está incidiendo exclusivamente la radiación electromagnética de la fuente, muy lejana, sino también de la superficie metálica rugosa, muy cercana al analito dado que se encuentra adsorbido sobre la misma. Como la intensidad de la señal depende del campo electromagnético que incide sobre la misma (I α E2), la señal en estas condiciones es muy superior a la del espectro Raman convencional [1,3,5,7]. Este efecto es parecido al producido por un aumento en la cantidad de fotones que inciden sobre la muestra. Al haber un mayor numero de los mismos la probabilidad de que ocurran fenómenos de dispersión, así como de absorción, es mayor, lo que se traduce en un aumento de la sección eficaz [5].

El campo eléctrico generado por los LSPR decae rápidamente con la distancia, por lo que para que se produzca la intensificación de la señal la partícula debe estar cerca de los mismos. La distancia donde el campo electromagnético es eficaz depende de la naturaleza del metal y de la morfología de las nanopartículas. Así, para moléculas esféricas como la mostrada en la figura 4, este disminuye según [R/(R+d)]12, donde R es el radio de la nanopartícula y d la distancia al centro de la partícula, siendo generalmente esta distancia de ~100 Å para que se detecte la intensificación de la señal. En la figura 5 se observan los campos electromagnéticos teóricos de otras geometrías.

Tal y como se aprecia en esta figura, el incremento del campo electromagnético es heterogéneo, dado que se localiza y concentra en puntos particulares según la geometría de las partículas. Estos puntos, conocidos como hot spots, se localizan en partículas esféricas en los espacios entre las mismas cuando estas están muy próximas, mientras que en el caso de partículas no esféricas se dan en las zonas de máxima curvatura (vértices en prismas y crestas y valles en superficies nanorrugosas) [5]. De este modo, tanto la morfología de las nanopartículas metálicas, como la distancia de la molécula a la superficie metálica y la orientación de la misma sobre esta la superficie son factores a tener en cuenta para optimizar el mecanismo de intensificación electromagnético [1].

2. Mecanismo químico o de transferencia de carga (CT)

Cuando la molécula se adsorbe a la superficie metálica mediante el mecanismo de quimisorción, es decir, mediante una interacción fuerte, se produce una polarización en la nube electrónica del adsorbato, formándose un complejo superficial con distinta simetría y estados electrónicos nuevos. Esto posibilita una transferencia electrónica entre el metal y los orbitales del complejo formado. La relajación posterior al estado electrónico fundamental pero vibracionalmente excitado, emitiéndose a una frecuencia menor; siendo la diferencia entre la incidente y la emitida la frecuencia de vibración del nivel de llegada. De esta forma es un proceso muy semejante al de resonancia Raman[1,5].

Los posibles procesos entre el metal y el complejo superficial formado se observan en la figura 6, siendo el más común el que se da entre el nivel de Fermi del metal y el orbital LUMO del complejo [1].

Este mecanismo produce una intensificación del orden de 102, mientras que el EM supone una intensificación mayor a 104 [3].

SUBSTRATOS SERS

La selección del substrato, así como su fabricación, supone el factor más crucial del uso de la técnica SERS y se realiza de forma que se obtenga la máxima amplificación de la señal y el experimento sea altamente reproducible [3,5,8]. Los substratos más comúnmente empleados son:

• Electrodos cuya superficie es rugosa por la aplicación de diversos ciclos de oxidación-reducción.
• Películas de islotes metálicos.
• Coloides metálicos.
• Nanoestructuras litografiadas sobre una superficie.

Siendo las mas empleadas, por no requerir de técnicas sofisticadas para su fabricación y ser adecuadas para su uso en disolución, los coloides metálicos [3,5]. Los metales más empleados a tal efecto son Au, Ag y Cu, dado que presentan propiedades dieléctricas que permiten la excitación de los plasmones en la región visible con muy baja resistividad [1,2].

ESPECTROS SERS

Los espectros obtenidos mediante esta técnica suelen diferir de los Raman convencionales. Esto es debido a los mecanismos de intensificación de la señal, estando más relacionado con el mecanismos CT que el EM.

Así, puede variar la intensidad relativa de las bandas del espectro, por el efecto resonante del plasmón y el complejo formado; desplazarse a longitudes de onda distintas, por los cambios químicos que produce sobre la molécula la formación de dicho complejo; ensanchamiento de las bandas, por la aparición de nuevos estados moleculares distintos; y la aparición de nuevas líneas, debido a que los fuertes gradientes del campo dan lugar a reglas de selección distintas para esta técnica [4,5].

La otra gran diferencia, lógicamente, es que la intensidad de las líneas Raman es mayor de la encontrada en los espectros Raman convencionales.

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Ventajas e inconvenientes de la espectroscopía SERS

Las ventajas que presenta esta técnica son [3]:

• Al ser vibracional proporciona una mayor información acerca de la estructura y el entorno que las electrónicas.
• Bloqueo de la fluorescencia al proporcionar la superficie metálica caminos de relajación no radiantes.
• Al ser Raman una técnica complementaria a la absorción IR proporciona información única muy valiosa, fácilmente adquirible gracias a intensificación de la señal.
• El fuerte decaimiento del campo con la distancia a la superficie metálica asegura que sólo se observe las señales de las moléculas adsorbidas sobre esta o muy cercanas por lo que es una técnica idónea para el estudio de superficies.
• La flexibilidad de la disposición óptica permite cambios en la configuración de los instrumentos, siendo por ejemplo aplicable en cámaras de alto vacío y células de flujo líquido.
• La señal del agua es muy poco intensa, por lo que puede aplicarse a moléculas en medio acuoso.

Siendo los principales inconvenientes [3]:

• La limitación en la selección de los metales a emplear, dado que plata, oro y cobre son los que presentan un mayor incremento de la señal.
• La dificultad de controlar las propiedades texturales de las nanopartículas, debiendo ser caracterizados mediante el uso de técnicas no del todo adecuadas para superficies rugosas. Además la reproducibilidad de las mismas así como su estabilidad son limitadas.
• Aplicabilidad limitada cuando el contacto entre la molécula y el sustrato no es directo. Es decir, escasa señal cuando la molécula no es capaz de adsorberse ya sea por fisi- o quimisorción.
• Ruido de fondo continuo, que aunque está registrado puede llegar a ocultar las señales SERS de baja intensidad y limitar el rango dinámico de medición.

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Aplicación de la microscopía SERS para la detección de fármacos en células

Una de las grandes promesas de esta técnica se encuentra en la posibilidad de realizar mediciones de una sola molécula, lo que supone una gran ventaja en el ámbito de la bioquímica y la medicina [2-4].

Para realizar este tipo de experimentos se utiliza la instrumentación de la figura 7. Como se aprecia en la misma el microscopio es utilizado tanto para la excitación como para la recolección de la dispersión Raman [4].

La utilización de esta técnica en el campo de la medicina, para la obtención de diagnósticos, como muchos tipos de cáncer; la detección de fármacos; estudios sobre la cinética intracelular… se encuentra aún en desarrollo. Sin embargo, dada la potencialidad de la misma se ha seleccionado un ejemplo de aplicación dentro de este ámbito.

Los científicos Michel Manfait y Igor Chourpa [9] han demostrado como mediante el uso de la microscopia SERS puede detectarse el fármaco mitoxantrona, utilizado para el tratamiento de muchos tipos de cáncer, y conocer, de este modo la distribución de los mismos en el interior celular.

Para ello el proceso seguido fue el descrito en la figura 8. En un primer lugar se analizaron los espectros en disolución para obtener espectros de referencia y posteriormente realizar la medida en el interior de las células.

Mediante la obtención de estos espectros se observa que no existen perturbación sobre la molécula ni sobre el complejo mitoxantrona-ADN tal y como se muestra en la figura 9. Asimismo, se observa la intensificaciones de las señales debido al efecto SERS. La comparación de los espectros obtenido junto con la asignación dada a las bandas permite decir que los anillos A y B son los que se intercalan a la doble hélice del ADN, mientras que el anillo C permanece fuera de la misma.

Figura 9. Comparación de los espectros SERS y Raman de resonancia obtenidos para la disolución excitando a 514’5 nm. La banda a 1300cm-1 corresponde a la vibración de estiramiento del anillo acoplada con el movimiento de estiramiento del CO. Esta banda es muy sensible a la formación del complejo, por lo que se reduce su intensidad cuando se forma el complejo mitoxantrona-ADN [9].

La comparación de los espectros así obtenidos con los obtenidos en el interior de la célula, demuestran que esta técnica es aplicable para análisis in vivo (figura 10). El uso de la técnica SERS permite también la obtención de imágenes Raman, como se muestra en la figura 11.

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Conclusiones

La técnica de espectroscopia Raman intensificada por superficies (SERS) permite expandir el uso de la espectroscopia Raman a una alta variedad de campos de

aplicación donde el Raman convencional no era utilizable. Dado que la información que proporciona esta técnica no puede obtenerse por medio del uso de otras técnicas, este hecho es de gran importancia.

La posibilidad de obtener señales de mayor intensidad, que se ven menos comprometidas por la emisión de fluorescencia, aumentando tanto la sección eficaz de las líneas Raman como la resolución espectral, pudiendo realizarse experimentos en medio acuoso o incluso sobre una única molécula, obteniendo información estructural y también sobre la orientación que toman los adsorbatos sobre la superficie, hacen de esta técnica el futuro de muchas aplicaciones.

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Bibliografía

1. Elena del Puerto Nevado. Detección y caracterización de quinacridonas de altas prestaciones mediante espectroscopías moleculares (Raman y fluorescencia) intensificadas por nanopartículas mecánicas. [Tesis doctoral]. Valladolid: Universidad de Valladolid; 2012.
2. Sur UK. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Recent advancement of Raman spectroscopy. Resonance. 2010; 15 (2). 154-164.
3. Haynes CL, McFarland AD, Van Duyne RP. Surface-Enhanced Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 2005; 77 (17): 338 A-346 A.
4. Kneipp K, Kneipp H, Itzkan I, Dasari RR, Feld MS. Surfaced-enhanced Raman scattering and biophysics. Journal of Physics: Condensed Matter. 2002; 14: R597- R624.
5. Irene Izquierdo Lorenzo. Adsorción y detección ultrasensible de sustancias  de dopaje deportivo  sobre  nanopartículas  plasmódicas  [Tesis  doctoral  en  internet]. Madrid: Universidad Complutense de Madrid; 2012.
6. Deschaines TO, Wieboldt D, Practical applications of surface-enhanced Raman scattering (SERS). Thermo Scientific. Technical Note: 51874.
7. Hicks CJ. SERS. Surface enhanced Raman spectroscopy.  Michigan  State University; 2001.
8. Dieringer JA, McFarland AD, Shah NC, Stuart DA, Whitney AV, Yonzon CR et al. Surface enhanced Raman spectroscopy: new materials, concepts, characterization tools, and applications. Faraday Discussions. 2006; 132: 9-26.
9. Horiba Scientific. SERS for intracellular imaging [Application note].